夏成興，孫王宏，馮相鑫，王海峰，顏汝平，何進，禹路，楊德林

(昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，昆明650101)

眼鏡蛇毒膜毒素12(MT-12)是從中華眼鏡蛇毒粗毒中提取出來的一種堿性膜活性多肽[1]，屬于三指毒素家族，該家族蛋白可以通過高度特異性靶向不同的受體和離子通道實現(xiàn)包括抗炎、抑癌、殺菌等藥理作用。其中其抑癌作用近年來在多種腫瘤的研究中被廣泛報道[2]。本課題組近年來針對MT-12對膀胱癌的抑癌作用進行了系列研究，發(fā)現(xiàn)MT-12在不殺傷正常膀胱上皮細胞的情況下，具有抑制膀胱癌細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用[3]。但是關(guān)于MT-12抑制人膀胱癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用及分子機制尚不明確。2016年7月～2017年7月，我們應用MT-12作用于膀胱癌細胞系T24、RT4，觀察其對膀胱癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響，探討MT-12抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制，為膀胱癌的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 MT-12單體提取于中華眼鏡蛇毒，由中國科學院昆明動物所動物毒素研究室惠贈；為考察多種膀胱癌細胞，納入兩種人膀胱癌細胞系，分別為膀胱移行上皮細胞癌細胞T24、膀胱移行細胞乳頭狀瘤細胞RT4，均由昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院中心試驗室提供；促瘤劑佛波酯(PMA)購于美國Sigma-Aldrich公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國GIBCO公司；TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan PCR Master Mix試劑盒購于美國Applied Biosystems公司；ELISA試劑盒購于上海凱基公司。

1.2 藥物配制 MT-12溶液：將1 g MT-12溶于200 mL DMSO溶液里，配置為5 g/L的貯存濃度，-20 ℃保存。使用時，應用培養(yǎng)基稀釋獲得MT-12工作濃度，分別為0.10、0.25、0.50 μg/mL。PMA溶液：用無水乙醇溶解1 mg PMA，配制成1 mol/L儲存液，-20 ℃保存。使用時應用培養(yǎng)基稀釋成100 nmol/L的工作液。

1.3 細胞培養(yǎng) 細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%及飽和濕度的條件下培養(yǎng)。

1.4 細胞遷移能力測算 采用細胞劃痕實驗。將T24、RT4細胞以5×105/孔的密度分別接種于6孔板中，設置空白對照組(Ctrl組)、溶媒對照組(NC組)、0.25 μg/mL組、0.50 μg/mL MT-12組，分別應用PBS、0.1%DMSO、0.25 μg/mL MT-12、0.50 μg/mL MT-12處理細胞24 h。當細胞鋪滿板時，用200 μL移液器吸頭沿底部作“一”字劃痕，處理細胞24 h后觀察測量劃痕距離變化并拍照，計算細胞遷移抑制率=(處理組處理前劃痕寬度-處理組處理后劃痕寬度)/(空白對照組處理前劃痕寬度-空白對照組處理后劃痕寬度)×100%。

1.5 細胞黏附能力測算 采用細胞黏附實驗。將處于對數(shù)生長期的T24、RT4細胞以1×105/孔接種于24孔板，當細胞單層鋪滿時，設置空白對照組(Ctrl組)、溶媒對照組(NC組)、0.25 μg/mL、0.50 μg/mL MT-12組，分別應用PBS、0.1%DMSO、0.25 μg/mL MT-12、0.50 μg/mL MT-12處理2 h后，去除未黏附的細胞，每孔加100 μL的0.25% Rose Bengal染色液，室溫靜置5 min后，吸棄染料，每孔加入1∶1的95%乙醇溶液和PBS 200 μL，室溫靜置30 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀波長570 nm處測定各孔的吸光度(D)值。細胞黏附率=(內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞D值-內(nèi)皮細胞D值)/內(nèi)皮細胞D值×100%。

1.6 細胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9酶活性含量檢測 采用凝膠酶譜分析法。將T24、RT4細胞接種于6孔板中。待細胞鋪滿后，設置空白對照組(Ctrl組)、MT-12組、PMA組、PMA+MT-12組，分別應用PBS、0.50 μg/mL MT-12、100 nmol/L PMA、0.50 μg/mL MT-12+100 nmol/L PMA干預細胞24 h。24 h后裂解細胞，4 ℃離心，取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。配制10% SDS-PAGE膠，其中分離膠含0.1%Ⅳ型膠原。將各組的樣品提取的蛋白，加入泳道(按每泳道100 μg蛋白量計算樣品上樣量，上樣量6～20 μL)，電流強度20 mA，4 ℃電泳90 min，將膠帶置入含2.5% Triton-X 100的培養(yǎng)皿室溫振蕩30 min洗脫后，再加入酶反應液 37 ℃搖床過夜。0.5%考瑪斯亮藍R-250染色室溫振蕩30 min，放入脫色液中至膠原酶消化區(qū)透明清晰為止。凝膠于UV Ipro凝膠圖像分析系統(tǒng)下觀察并攝像，讀取各消化條帶的灰度和面積，計算酶解活性含量=條帶面積×(條帶灰度-背景灰度)。

1.7 細胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。將T24、RT4細胞接種于6孔板中。待細胞鋪滿后，設置空白對照組(Ctrl組)、MT-12組、PMA組、PMA+MT-12組，分別應用PBS、0.50 μg/mL MT-12、100 nmol/L PMA、0.50 μg/mL MT-12+100 nmol/L PMA干預細胞24 h。TRIzol一步法提取總RNA，cDNA合成及RT-PCR實驗步驟按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，RT-PCR試劑盒的說明書完成。侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子各引物分別為：內(nèi)參β-actin 正向序列5′-TCCGTGACATCAAGGAGAAGC-3′，反向序列5′-GCACCGTGTTGGCGTAGAG-3′；細胞間黏附因子-1(ICAM-1)正向序列5′-ACCACAGGAGCAACTTCT-3′，反向序列5′-CGTTCAGGACCACTTCAC-3′；血管黏附因子-1(VCAM-1)正向序列5′-ACTTCTGGTTGCTCTATTGTG-3′，反向序列5′-CAGTCATCTCAGTGGTAGTG-3′；血管生成因子(VEGF)正向序列5′-AGGGCAGAATCATCACGAA-3′，反向序列5′-TCTTGCTCTATCTTTCTTTGGTCT-3′。

1.8 細胞VEGF蛋白表達檢測 采用ELISA法。于6孔板中培養(yǎng)T24、RT4細胞，待細胞鋪滿后，設置空白對照組(Ctrl組)、MT-12組、PMA組、PMA+MT-12組，分別應用PBS、0.50 μg/mL MT-12、100 nmol/L PMA、0.50 μg/mL MT-12+100 nmol/L PMA干預細胞24 h。取對數(shù)生長期細胞嚴格按照說明書進行操作，VEGF水平采用電化學發(fā)光法進行檢測，所用儀器為 Lumat LB9507化學發(fā)光分析儀。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞遷移能力比較 T24和RT4細胞中，0.25 μg/mL MT-12組、0.50 μg/mL MT-12組細胞遷移抑制率均低于NC組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組細胞黏附能力比較 T24和RT4細胞中，0.25 μg/mL MT-12組、0.50 μg/mL MT-12組細胞黏附率均低于NC組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞遷移、黏附能力比較

2.3 各組細胞MMP-2、MMP-9酶活性比較 T24和RT4細胞中，MT-12組MMP-9酶活性均低于Ctrl組(P均<0.05)，PMA組MMP-9酶活性均高于Ctrl組，PMA+MT-12組MMP-9酶活性均低于PMA組(P均<0.05)。T24和RT4兩株細胞中，各組間MMP-2酶活性差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1～4。

注：1為Ctrl組；2為MT-12組；3為PMA組；4為PMA+MT-12組。

2.4 各組細胞ICAM-1、VCAM-1、VEGF mRNA表達比較 T24和RT4細胞中，MT-12組ICAM-1及VEGF的mRNA表達均低于Ctrl組(P均<0.05)，而VCAM-1差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。PMA組ICAM-1及VEGF mRNA表達均高于Ctrl組，PMA+MT-12組ICAM-1、VEGF mRNA表達均低于PMA組(P均<0.05)。見圖5～7。

2.5 各組細胞VEGF蛋白表達比較 T24和RT4細胞中，MT-12組與Ctrl組VEGF蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；PMA組VEGF蛋白表達均高于Ctrl組，PMA+MT-12組VEGF蛋白表達均低于PMA組(P均<0.05)。見圖8。

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，近年來發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢[4,5]，10%～30%的病例會進展為具有高度侵襲性、可迅速進展和轉(zhuǎn)移的肌層浸潤性膀胱癌[6]，預后往往不佳[7]。故探討膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，研究抑制其轉(zhuǎn)移能力的藥物，在膀胱癌抗腫瘤研究中尤為重要。

圖3 T24、RT4細胞中MMP-2酶活性表達比較

注：與Ctrl組比較，*P<0.05；與PMA組比較，#P<0.05。

注：與Ctrl組比較，*P<0.05；與PMA組比較，#P<0.05。

注：與Ctrl組比較，*P<0.05。

注：與Ctrl組比較，*P<0.05；與PMA組比較，#P<0.05。

注：與Ctrl組比較，*P<0.05；與PMA組比較，#P<0.05。

MT作為眼鏡蛇毒中提取的膜活性多肽，其對腫瘤的選擇性殺傷作用近年來被廣泛報道[8]。有學者報道了MT同類毒素CTX1對不同細胞系的毒性作用，包括癌細胞(MCF-7、P388、K562、H22)和正常支氣管上皮細胞16HBE，發(fā)現(xiàn)CTX1對腫瘤細胞的毒性顯著高于正常細胞[9]。同時大量研究表明，MT也可一定程度抑制腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。有學者在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CTXⅢ能夠通過抑制EGF/EGFR和Src介導的信號傳導途徑來抑制細胞轉(zhuǎn)移[10]；在口腔癌中，CTXⅢ可以通過MAPK和MMP信號傳導途徑抑制癌細胞的增殖和遷移[11]。因此，MT-12作為中華眼鏡蛇MT單體，可能具有抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)，RT4和T24兩株細胞中，0.25 μg/mL MT-12組、0.50 μg/mL MT-12組細胞遷移抑制率、細胞黏附率均低于NC組，提示MT-12低濃度(0.25 μg/mL)及高濃度(0.50 μg/mL)可明顯抑制膀胱癌細胞遷移及黏附；考慮到RT4是膀胱移行細胞乳頭狀瘤，T24是膀胱移行上皮細胞癌，兩種細胞的惡性程度不同、腫瘤驅(qū)動基因不同、基因突變情況不同，固而本研究結(jié)果也表明MT-12對不同膀胱癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移均有顯著抑制作用。

腫瘤發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移是影響患者預后的重要原因。研究表明，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤細胞與其細胞外基質(zhì)之間的相互作用密切相關(guān)[12]。而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和絲氨酸蛋白水解酶介導的基膜和細胞外基質(zhì)的降解和細胞遷移過程貫穿于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的整個過程[13]。其中MMPs是一種鰲合了鋅離子的蛋白酶類，主要作用底物為細胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原蛋白，通過降解細胞外基質(zhì)，可以促進細胞向周圍組織及血管的侵襲轉(zhuǎn)移能力[14]。在腫瘤細胞中，MMPs表達量往往顯著高于正常細胞，且其表達及活性與腫瘤細胞的惡性程度呈正相關(guān)[15]。其中Ⅳ型膠原蛋白酶是內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞分泌的MMPs中最重要的一個，其主要形式為糖化的MMP-9及非糖化的MMP-2[16]。Fiorentini等[17]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制MMP-2和MMP-9的活性降低了人轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞和膀胱癌細胞的侵襲性。Yue等[18]研究也證實，人參皂苷Rg3可通過降低細胞MMP-9的活性，抑制惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前，MMP-9已成為評估腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要指標，靶向MMP-9已成為臨床防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要策略。本研究結(jié)果顯示，RT4和T24兩株細胞中，MT-12組MMP-9酶活性均低于Ctrl組，提示MT-12可能通過抑制 MMP-9的活性，減緩細胞外膠原蛋白的降解，進而抑制細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

VEGF在腫瘤的侵襲過程中有著重要的地位，不但可以促進腫瘤血管生成，同時可促進血管內(nèi)皮細胞的收縮，從而加速腫瘤向血管浸潤的過程[19,20]。研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細胞可旁分泌大量VEGF，提高局部血管通透性，導致周圍纖維蛋白沉著，促進單核細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的浸潤，有利于形成腫瘤基質(zhì)，促進腫瘤細胞進入新生血管，增強其轉(zhuǎn)移能力[21]。Nowicki等[22]研究表明，VEGF作為血管內(nèi)皮特異性標記物，在肝癌患者血清中升高，并且與侵襲性、轉(zhuǎn)移和生存期較短密切相關(guān)。因而，降低細胞VEGF的表達，是抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的潛在靶點。本研究結(jié)果顯示， MT-12組VEGF mRNA表達均低于Ctrl組，提示MT-12對膀胱癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的抑制作用可能與其抑制VEGF mRNA及蛋白表達有關(guān)。

細胞黏附分子(CAMs)在調(diào)控腫瘤細胞的黏附及轉(zhuǎn)移中同樣起到重要作用。CAMs是一類調(diào)節(jié)細胞與細胞之間，細胞與胞外基質(zhì)間相互結(jié)合并起黏附作用的膜表面糖蛋白[23]。在對腫瘤生物學行為的研究中，CAMs中的ICAM-1及VCAM-1對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力影響的研究較多[24]。研究表明，當腫瘤細胞大量表達ICAM-1及VCAM-1時，可促進腫瘤細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞，同時大量富集巨噬細胞，促進VEGF等生長因子的分泌，最終導致腫瘤微血管生成，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移[25]。Tuncer等[26]在結(jié)直腸癌中通過增強TSP-1和ICAM-1的表達改變內(nèi)皮細胞特征，發(fā)現(xiàn)可增強細胞的侵襲能力。本研究發(fā)現(xiàn)，MT-12組ICAM-1 mRNA表達均低于Ctrl組，提示MT-12可能通過抑制ICAM-1的表達，抑制腫瘤細胞的黏附能力，從而抑制不同膀胱癌細胞的轉(zhuǎn)移。

同時，為進一步明確MT-12對膀胱癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移抑制作用的分子機制，我們將PMA處理膀胱癌細胞納入本研究。PMA作為高效促瘤劑，通過活化蛋白激酶C，激活下游信號通路，促進腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，PMA+MT-12組MMP-9酶活性、ICAM-1 mRNA、VEGF mRNA及蛋白表達均高于Ctrl組，表明PMA進一步增強了膀胱癌細胞的促瘤作用；PMA+MT-12組MMP-9酶活性、ICAM-1 mRNA、VEGF mRNA及蛋白表達均低于PMA組，提示MT-12對膀胱癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的抑制作用涉及對細胞MMP-9、VEGF、ICAM-1的調(diào)控。

綜上所述，MT-12可以有效抑制膀胱癌細胞的遷移及轉(zhuǎn)移能力，其發(fā)揮抑制作用的分子機制可能為降低腫瘤細胞中MMP-9、VEGF、ICAM-1的表達。