萬(wàn)鳳 楊汝春? 時(shí)延朋 張華琴

腎小管間質(zhì)纖維化（TIF）是各種慢性腎臟?。–KD）進(jìn)展至終末期腎?。‥SRD）的共同通路和主要病理特征［1］。研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）是TIF發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)［2］。EMT受多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，其中最重要的是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）。實(shí)驗(yàn)表明TGF-β1參與多數(shù)腎臟病中進(jìn)展性腎纖維化的病理形成［3］。目前，有關(guān)桑黃提取物在腎小管上皮細(xì)胞EMT發(fā)生中的作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文以大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察桑黃PA、PW和PP對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）細(xì)胞株：大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞系目錄號(hào)GNR 8。（2）藥物與試劑：PA、PW和PP均由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。胎牛血清（Gibco），DMEM低糖培養(yǎng)基，0.25%胰酶-EDTA，雙抗、CCK-8試劑盒均購(gòu)自杭州達(dá)文生物有限公司；RT-PCR引物由上海生工生物有限公司合成。TGF-β1（R＆D公司），TRIzol reagent（Invitrogen），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTM均自TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素和0.1g/L鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，進(jìn)行換液1次/1～2d。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%融合時(shí)，用含0.25%胰酶-EDTA溶液進(jìn)行消化細(xì)胞，吹打均勻并傳代。

1.3 CCK-8法測(cè)定NRK-52E細(xì)胞存活率 消化收集對(duì)數(shù)增殖期NRK-52E細(xì)胞并以1×108/L的密度接種于96孔板，每孔100μl，細(xì)胞貼壁后用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24h。之后實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的采用含2%FBS DMEM培養(yǎng)基配制的倍比稀釋的PA、PW和PP，每孔100μl，終濃度分別為1.562、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200和 400μg/ml，對(duì)照組加入等體積2% DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48h后每孔加入10μl CCK-8 溶液，37℃反應(yīng)2h后于450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔吸光度值。細(xì)胞生存率及增殖抑制率按如下公式計(jì)算：生存率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD）×100%。抑制率（%）=（1-生存率）×100%。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將NRK-52E接種在6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)進(jìn)行無(wú)血清同步化處理24h，之后將NRK-52E細(xì)胞隨機(jī)分為5組：（1）對(duì)照組。（2）誘導(dǎo)組：只添加10ng/mlTGF-β1。（3）PA干預(yù)組：10ng/ml TGF-β1+100μg/ml PA。（4）PW干預(yù)組：10 ng/ml TGF-β1+200μg/ml PW。（5）PP干預(yù)組：10ng/ml TGF-β1+200 μg/ml PW。

1.5 RT-PCR檢測(cè)EMT相關(guān)基因mRNA水平的表達(dá) PA、PW和PP分別處理NRK-52E 24 h，收集細(xì)胞，TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。取所提取的2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行熒光定量PCR，GAPDH作為內(nèi)參。E-cadherin的上游引物：AACAACTGCATGAAGGCGATCTCC，下游引物TTGACCACCGTTCTCCTCCGTAG，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度137bp；α-SMA的上游引物：GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC，下 游 引 物：CCATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC， 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為150bp；Desmin的上游引物：AATGACCGCTTCGCCAACTACTTC， 下 游 引 物：GCTCTCGCATCTCCTCCTCGTAG，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為139 bp；GAPDH的上游引物：ACCACAGTCCATGCCATCAC，下游引物：TCCACCACCCTGTTGCTGTA，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為453 bp。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，方差齊者，多組間采用one-way ANOVA，組間兩兩比較用LSD法；如方差不齊，采用Tamhane's T2。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PA對(duì)NRK-52E細(xì)胞增殖的影響 CCK-8結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低濃度的PA對(duì)NRK-52E細(xì)胞無(wú)明顯的抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到200μg/ml時(shí)，PA可顯著抑制NRK-52E的增殖效應(yīng)，抑制率達(dá)到56%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)PA濃度達(dá)到400μg/ml時(shí)，其對(duì)NRK-52的抑制率高達(dá)68%，較對(duì)照組差異性顯著（P＜0.01）。

2.2 PW對(duì)NRK-52E細(xì)胞的增殖效應(yīng) CCK-8結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低濃度的PW對(duì)NRK-52E細(xì)胞無(wú)明顯的抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到400μg/ml時(shí)，PW可顯著抑制NRK-52E的增殖作用，抑制率達(dá)到50%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 PP對(duì)NRK-52E細(xì)胞的增殖效應(yīng) CCK-8結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低濃度的PP對(duì)NRK-52E細(xì)胞無(wú)明顯的增殖效應(yīng)，當(dāng)濃度達(dá)到12.5μg/ml和25μg/ml時(shí)，其增殖率分別達(dá)到175%和176%，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。然而，隨著濃度的繼續(xù)增加，其增殖作用趨于減弱。當(dāng)濃度達(dá)到400μg/ml時(shí)，PP反而抑制NRK-52E的增殖效應(yīng)，抑制率達(dá)到38%（P＜0.05）。

2.4 桑黃不同濃度提取物對(duì)NRK-52E細(xì)胞EMT相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 基于CCK-8結(jié)果，分別選取100μg/ml PA、200μg/ml PW和200μg/ml PP用于后續(xù)的EMT干預(yù)實(shí)驗(yàn)。RT-PCR結(jié)果顯示TGF-β1誘導(dǎo)組中α-SMA和desmin的表達(dá)均較正常組明顯增加（P＜0.01），E-cadherin則較正常組顯著降低（P＜0.01）。而經(jīng)PA、PW和PP干預(yù)之后，NRK-52E細(xì)胞中的α-SMA和desmin較模型組明顯降低（P＜0.01或 P＜0.05），E-cadherin 表達(dá)增加（P＜0.01 或 P＜0.05），其中PP的干預(yù)效果最佳。綜上，PA、PW和PP均可抑制NRK-52E細(xì)胞的EMT作用。見(jiàn)圖1-3。

3 討論

圖1 桑黃不同提取物對(duì)α-SMA表達(dá)的影響（與對(duì)照組比較，??P＜0.01；與TGF-β1模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01）

圖2 桑黃不同提取物對(duì)demin表達(dá)的影響（與對(duì)照組比較，??P＜0.01；與TGF-β1模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01）

圖3 桑黃不同提取物對(duì)E-cadherin表達(dá)的影響（與對(duì)照組比較，??P＜0.01；與TGF-β1模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01）

桑黃，又稱桑臣、桑耳、桑黃菇等，是寄生于桑樹(shù)等闊葉樹(shù)的一種藥用真菌。桑黃的主要成分包括多糖、甾體、黃酮類物質(zhì)、酚類物質(zhì)、萜類、香豆素類物質(zhì)及生物堿［4］。桑黃具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化［5］、抗血管生成［6］、降血糖［7］、自由基清除［8］、免疫調(diào)節(jié)［9］和抗腫瘤作用［10］。桑黃是活血化瘀藥，其子實(shí)體入藥，味微苦，性寒，具有活血、化飲、補(bǔ)虛、清熱解毒之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明多糖、黃酮和萜類是其主要活性成分。桑黃是一種珍貴的藥用真菌，已吸引國(guó)內(nèi)外越來(lái)越廣泛的關(guān)注。研究證實(shí)桑黃具有抗腫瘤、抗肝纖維化和抗氧化等作用。桑黃的抗肝纖維化作用在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)。然而，桑黃是否具有抗腎纖維化作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

在本研究中，首先評(píng)估了不同濃度PA、PW和PP對(duì)NRK-52E細(xì)胞增殖的影響。在此基礎(chǔ)上，作者分別選取了100μg/ml PA、200μg/ml PW和200μg/ml PP三個(gè)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用的濃度用于后續(xù)的EMT干預(yù)實(shí)驗(yàn)。RT-PCR結(jié)果顯示TGF-β1組中E-cadherin較正常組明顯降低，而α-SMA和desmin較正常組明顯增加。而經(jīng)PA、PW和PP干預(yù)之后，NRK-52E細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)較TGF-β1組明顯上調(diào)，α-SMA和desmin則明顯降低，其中以PP的效果最為明顯，推測(cè)PP可能是桑黃中抑制NRK-52E發(fā)生EMT最有效的成分。

綜上所述，桑黃不同提取物可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。EMT是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程，阻斷其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)均有可能抑制其進(jìn)程。本文僅檢測(cè)了EMT發(fā)生的下游效應(yīng)因子，其具體機(jī)理尚不明確，還有待于進(jìn)一步的探究。