聶靜苑

（長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 長(zhǎng)沙 410016）

鐵皮石斛是蘭科植物鐵皮石斛加工后的干燥莖，因其喜好溫暖濕潤(rùn)的氣候和陰暗潮濕的環(huán)境，曾廣泛分布于福建、浙江、云南等南方地區(qū)。鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱等功用[1-4]。醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛具有抗腫瘤、降血糖、調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化及抗疲勞等多種藥理作用。國(guó)家衛(wèi)計(jì)委已于2018年1月將鐵皮石斛列入食藥同源名單。近年，由于鐵皮石斛被長(zhǎng)期無(wú)節(jié)制的采摘，野生鐵皮石斛已成為瀕危藥材。目前市場(chǎng)上流通的鐵皮石斛，主要來(lái)自人工栽培。隨著鐵皮石斛種植的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，人工栽培技術(shù)的大量應(yīng)用，鐵皮石斛的產(chǎn)量已基本滿(mǎn)足人們的需要。然而栽培過(guò)程中，農(nóng)藥的濫用、超量使用問(wèn)題日益嚴(yán)重，農(nóng)藥殘留嚴(yán)重影響鐵皮石斛的質(zhì)量，鐵皮石斛的質(zhì)量安全問(wèn)題已引起人們的廣泛關(guān)注[5-10]。

有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥（OPP）是一種廣譜、低廉、高效的殺蟲(chóng)劑，在殺蟲(chóng)、殺菌、除草、植物的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中均有廣泛應(yīng)用，也是我國(guó)目前使用最多、應(yīng)用最廣的一類(lèi)農(nóng)藥，其檢測(cè)對(duì)于食品安全質(zhì)量控制有積極意義。本文采用固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）對(duì)新鮮鐵皮石斛中的5種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量進(jìn)行檢測(cè)，為鐵皮石斛的質(zhì)量安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890B-5977B氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀[安捷倫（中國(guó)）]；HP-5 MS色譜柱[安捷倫（中國(guó)）]；氨基固相萃取柱，容量為0.5 g/6 ml，上海安普）；全自動(dòng)高通量平行濃縮儀（Lab Tech）；XS DU205型電子天平[梅特勒（中國(guó)）]；X1R高速冷凍離心機(jī)（Thermo）。

1.2 試藥

環(huán)氧七氯（內(nèi)標(biāo)物），甲基對(duì)硫磷，殺螟硫磷，馬拉硫磷，對(duì)硫磷，殺撲磷標(biāo)準(zhǔn)品（均為100 μg/ml）均購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究所；氯化鈉：分析純（國(guó)藥集團(tuán)）；乙腈，甲苯均為色譜純（德國(guó)默克）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取已均質(zhì)好的新鮮鐵皮石斛樣品20 g，置入 100 ml 離心管，加入乙腈40 ml，氯化鈉4～6 g，勻漿提取2 min，5000 r/min 離心3 min，取上清10 ml，待凈化。

取氨基萃取柱，先后用乙腈:甲苯（5:1）5 ml活化萃取柱，當(dāng)淋洗液達(dá)到氨基柱頂部時(shí)，迅速將上述提取液10 ml轉(zhuǎn)移至凈化柱中，并用乙腈:甲苯（5:1）5 ml的分3次洗滌樣液瓶，一并轉(zhuǎn)移至凈化柱中。將收集后的凈化液置于60 ℃水浴中用氮吹儀吹至近干，用丙酮進(jìn)行溶劑交換，最后使體積為1 ml，加入10 μg/ml環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)液20 μl，混勻，用于色譜分析。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將100 μg/ml 的5種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別用丙酮稀釋至20 μg/ml濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取適量，用丙酮稀釋得0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0 μg/ml系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。取以上系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1 ml至已吹至近干的空白樣品基質(zhì)中，加入10 μg/ml環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)液20 μl，混勻，即為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2 色譜條件

毛細(xì)管色譜柱：HP-5 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；分流方式：不分流；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；氮?dú)饬髁浚? ml/min；柱溫：初始溫度60 ℃保持2 min，以20 ℃/min的速率升溫至160 ℃，以5 ℃/min的速率升溫至270 ℃，保持2 min。

2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊源（EI源）離子源；溫度：220 ℃；接口溫度：250 ℃； 溶劑延遲時(shí)間：1.5 min。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備及檢出限測(cè)定 按2.2、2.3項(xiàng)色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣2.1.2項(xiàng)下基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 μl，5種有機(jī)磷農(nóng)藥在線(xiàn)性范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）＞ 0.995。 以?xún)x器3倍噪聲比值（S/N）表1：甲基對(duì)硫磷（12.745 min）；2：殺螟硫磷（13.237 min）；3：馬拉硫磷（13.412，8.031min）；4：對(duì)硫磷（13.712 min）；5：殺撲磷（14.792 min）

表1 5種有機(jī)磷農(nóng)藥的線(xiàn)性、相關(guān)系數(shù)及檢出限

圖1 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖

3 討論

3.1 質(zhì)譜條件的確定

根據(jù)質(zhì)譜理論，樣品測(cè)定時(shí)，若檢出色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品一致，且扣除背景后，待測(cè)樣品的離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)樣品的離子豐度比一致，則可定性確證這種農(nóng)藥的存在。本法測(cè)定中，配制4 μg/ml的5種標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)以上色譜條件分別對(duì)5種有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行全掃描，確定母離子峰及其保留時(shí)間，再通過(guò)不斷更換碰撞能量對(duì)母離子進(jìn)行碎片離子掃描。每種農(nóng)藥化合物分別選擇一個(gè)定量離子，2個(gè)定性離子。以示方法的檢出限，在該色譜條件下，5 種農(nóng)藥的檢出限在0.001～0.006 mg/kg之間。5種有機(jī)磷農(nóng)藥的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的譜圖見(jiàn)圖1。

2.4.2 加標(biāo)回收及精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取已均質(zhì)好的新鮮鐵皮石斛樣品 20 g，置入100 ml離心管，加入最終質(zhì)量濃度分別為0.02 μg/ml（低），0.1 μg/ml（中），0.5 μg/ml（高）3個(gè)水平的5種有機(jī)磷農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1.1項(xiàng)方法處理樣品，每個(gè)水平的供試品溶液各3份，按2.2、2.3項(xiàng)色譜條件分析，得低、中、高3個(gè)濃度點(diǎn)的加標(biāo)回收率，其中0.1 μg/ml濃度點(diǎn)的加標(biāo)樣品平行測(cè)定6次，6次精密度測(cè)定結(jié)果的RSD及加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率及精密度測(cè)定結(jié)果

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取 已均質(zhì)好的樣品 20 g，置入100 ml 離心管，加入一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1.1項(xiàng)方法對(duì)樣品進(jìn)行萃取和凈化。同法處理6份樣品，對(duì)樣品進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。MRM模式對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。5種有機(jī)磷農(nóng)藥定量離子和對(duì)應(yīng)的兩個(gè)碎片定性離子對(duì)見(jiàn)表4。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表4 5種有機(jī)磷殘留離子相關(guān)信息

3.2 萃取溶劑的選擇

乙腈是農(nóng)殘檢測(cè)時(shí)常用的提取液, 由于乙腈極性較大，研究發(fā)現(xiàn)較早洗脫的極性組分會(huì)發(fā)生裂分, 為了降低乙腈的極性, 在乙腈提取液中加入沸點(diǎn)相近的極性較弱的溶劑如甲苯等，使用乙腈:甲苯（5:1）作為洗脫溶劑，色譜峰峰形較好。

本實(shí)驗(yàn)建立了固相萃取-GC-MS同時(shí)測(cè)定鐵皮石斛中5種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法。對(duì)質(zhì)譜條件和萃取溶劑進(jìn)行了優(yōu)化，分別考察了方法的重復(fù)性、精密度、回收率等。結(jié)果表明本方法的準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性均符合分析測(cè)試要求，可為鐵皮石斛中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測(cè)提供參考。