李云峰，魏振興，郭 靜，胡麗英

（常山凱捷健生物藥物研發(fā)（河北）有限公司，河北 石家莊 050800）

3-(二乙氧基磷?；?-氧-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮[3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotrizin-4(3H)-one，DEPBT]，是一種含磷肽縮合試劑，具有反應(yīng)條件溫和，底物氨基酸側(cè)鏈羥基、咪唑基等官能團(tuán)不需保護(hù)，產(chǎn)物消旋率低等優(yōu)點(diǎn)。DEPBT不僅可用于生物活性多肽的合成，而且可以作為縮合試劑用于酰胺鍵的縮合反應(yīng)[1-7]。本文參考相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)[8-11]建立了DEPBT純度測(cè)定的HPLC方法，所建立的方法簡(jiǎn)便、快捷、結(jié)果穩(wěn)定，可用于DEPBT的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

U3000型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo公司，包括HPG-3X00型四元泵、WPS-3000型自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3X00型柱溫箱、MWD-3000型檢測(cè)器），分析天平（Mettler Toledo公司，XS105DU）。

DEPBT供試品（蘇州昊帆生物，批號(hào):20171001），DEPBT對(duì)照品（Sigma，批號(hào)：BCBV2309），乙腈（Fisher，批號(hào)：165738），三氟乙酸（阿拉丁，批號(hào)：I1620036），均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6 mm×25 cm，5 μm）； 柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；樣品室溫度：5 ℃；流動(dòng)相A：0.1%三氟醋酸水溶液，B：0.1%三氟醋酸乙腈溶液：流速：1.0 ml/min，按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫表

2.2 溶液制備

對(duì)照品貯備溶液：取DEPBT對(duì)照品約50 mg，精密稱(chēng)定，置10 ml量瓶，加乙腈適量使溶解，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。

對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品貯備溶液1 ml，置10 ml量瓶，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取DEPBT供試品約12.5 mg，精密稱(chēng)定，置25 ml量瓶，加乙腈適量溶解，加乙腈稀釋至刻度，搖勻。

空白溶液：乙腈。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液20 μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。DEPBT保留時(shí)間RSD應(yīng)≤2.0%，峰面積RSD應(yīng)≤2.0% 。

連續(xù)進(jìn)樣6次，DEPBT保留時(shí)間RSD為0.03%，DEPBT峰面積RSD為1.72%。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別精密量取空白溶液、未破壞供試品溶液、酸破壞溶液（0.1 mol/L，鹽酸30 min）、堿破壞溶液（0.1 mol/L，氫氧化鈉1 min）、 高溫（40 ℃，24 h）破壞溶液、光照（4500 lux，48 h）破壞溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果空白溶液對(duì)檢測(cè)無(wú)影響；酸破壞與堿破壞溶液主要降解產(chǎn)物是未知化合物1（RRT0.7）；高溫破壞溶液主要降解產(chǎn)物是未知化合物1（RRT0.7）和未知化合物4（RRT1.1）；光照破壞溶液較穩(wěn)定。DEPBT峰與各降解雜質(zhì)峰，以及各降解雜質(zhì)峰間分離度均≥1.0，分離度良好，說(shuō)明該方法專(zhuān)屬性良好，圖譜見(jiàn)圖1～圖6。

圖1 空白溶液

圖2 未破壞供試品溶液

圖3 酸破壞供試品溶液

圖4 堿破壞供試品溶液

圖5 高溫破壞溶液

圖6 光照破壞溶液

2.5 線性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品貯備溶液定量稀釋制成每1 ml中含DEPBT 0.1，0.2，0.3，0.5，1.0，1.5，2.0 mg溶液，分別精密量取20 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以DEPBT峰面積為縱坐標(biāo)，DEPBT濃度為橫坐標(biāo)，線性方程為y=101.6146x-0.2945，R2為1.0000，證明線性關(guān)系良好。

2.6 精密度

2.6.1 重復(fù)性 平行制備DEPBT供試品溶液6份，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按面積歸一化法計(jì)算色譜峰純度，色譜峰純度應(yīng)≥97.0%，6份樣品色譜純度RSD應(yīng)≤2.0% 。結(jié)果，6份樣品色譜純度平均值為99.54%，RSD為0.31%。

2.6.2 中間精密度 取同一批樣品，在同一實(shí)驗(yàn)室由另一實(shí)驗(yàn)人員換用另一臺(tái)儀器，于不同時(shí)間重復(fù)2.6.1項(xiàng)下操作。結(jié)果，6份樣品色譜純度平均值為99.59%，RSD為0.17%。綜合重復(fù)性、中間精密度結(jié)果計(jì)算供試品的平均色譜純度為99.56%，RSD為0.21%。結(jié)果表明，本法精密度良好。

2.7 準(zhǔn)確度

對(duì)照品溶液：取DEPBT對(duì)照品約12.5 mg，精密稱(chēng)定，置25 ml量瓶，加乙腈適量溶解，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

80%供試品溶液：取DEPBT供試品約10 mg，精密稱(chēng)定，置25 ml量瓶，加乙腈適量溶解，加乙腈稀釋至刻度，搖勻。

100%供試品溶液：取DEPBT供試品約12.5 mg，精密稱(chēng)定，置25 ml量瓶，加乙腈適量溶解，加乙腈稀釋至刻度，搖勻。

120%供試品溶液：取DEPBT供試品約15 mg，精密稱(chēng)定，置25 ml量瓶，加乙腈適量溶解，加乙腈稀釋至刻度，搖勻。

每個(gè)濃度供試品平行制備3份，以外標(biāo)法計(jì)算各供試品溶液濃度，根據(jù)DEPBT加入量計(jì)算各濃度下回收率以及RSD，統(tǒng)計(jì)9份樣品總回收率及RSD。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 準(zhǔn)確度檢測(cè)結(jié)果

2.8 耐用性

調(diào)整色譜條件，分別測(cè)定精密度試驗(yàn)同批次樣品，以峰面積歸一化法計(jì)算色譜純度，以精密度測(cè)定色譜純度的平均值為100%，其他條件測(cè)定的色譜純度與平均色譜純度進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)純度。結(jié)果色譜條件微小改變后，相對(duì)峰純度在99.75%～100.07%之間 ，說(shuō)明色譜條件耐用性良好。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 耐用性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.9 溶液穩(wěn)定性

取2.6.1項(xiàng)下供試品溶液分別于0，2，4，6，8，12，16，24 h精密量取20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以0 h進(jìn)樣純度為100%，其他時(shí)間進(jìn)樣的相對(duì)峰純度為99.74%～99.98%，DEPBT溶液在5 ℃時(shí)穩(wěn)定性良好。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.10 定量限

取DEPBT對(duì)照品貯備液逐級(jí)稀釋?zhuān)M(jìn)樣，當(dāng)濃度為0.5 μg/ml時(shí)信噪比大于10，即0.5 μg/ml為定量限濃度。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)曾采用三氟醋酸:乙腈:水=0.1:30:70作為稀釋液，結(jié)果DEPBT水解嚴(yán)重，24 h水解率為99.25%，結(jié)果見(jiàn)表5，圖7，圖8。將稀釋液改為純乙腈后，溶液在5 ℃時(shí)穩(wěn)定性良好。

表5 三氟醋酸:乙腈:水=0.1:30:70作為稀釋液時(shí)穩(wěn)定性結(jié)果

圖7 稀釋液為三氟醋酸:乙腈:水=0.1:30:70穩(wěn)定性0 h

圖8 稀釋液為三氟醋酸:乙腈:水=0.1:30:70穩(wěn)定性24 h

專(zhuān)屬性試驗(yàn)可見(jiàn)，DEPBT對(duì)溫度特別敏感，為了消除溫度對(duì)檢測(cè)的影響，將樣品室溫度設(shè)為5 ℃，溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，5 ℃時(shí)DEPBT穩(wěn)定性良好。