張 雯，宋俊科，王海港，周啟蒙，王曉波，杜冠華

（中國醫(yī)學科學院 & 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥物研究所，北京市藥物靶點研究與新藥篩選重點實驗室，北京100050）

靈芝是一種傳統(tǒng)名貴藥材，也是可食用真菌，具有安神益氣、活血益筋、止咳平喘、扶正固本等功效。靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來的細小顆粒，富含人體必需氨基酸、糖肽、甾醇、生物堿和三萜類等物質(zhì)，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和保肝降糖等多種功能[1-2]。靈芝孢子有兩層質(zhì)地堅硬、耐酸的孢壁，阻礙機體的消化吸收，因此靈芝孢子需破壁服用[3-4]。

靈芝對免疫力的調(diào)節(jié)作用已有報道，但對破壁前后靈芝孢子粉的作用差異尚缺乏充分的認識。環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide）是醫(yī)學上常用的抗癌藥，也是常用的免疫抑制劑，可用于建立免疫低下的動物模型[5-6]。本實驗應用高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）測定破壁與不破壁靈芝孢子粉中靈芝酸A、C2、和D的含量，以環(huán)磷酰胺免疫低下小鼠作為模型動物，考察破壁機處理靈芝孢子粉對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制的調(diào)節(jié)作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JYL-Y8 PLUS營養(yǎng)破壁調(diào)理機（九陽）；JYL-C051料理機（九陽）；Agilent 1200高效液相色譜儀，Agilent 6110單四級桿質(zhì)譜儀（美國Agilent）；CascadaTMLS water純水儀（美國Pall）；Spectra Max M5酶標儀（美國Molecular Devices）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon）；XS105 DU電子天平（瑞士Mettler Toledo）；Vortex Genie 2渦旋震蕩儀（美國Scientific Industries）；MiniSpin常溫離心機（德國Eppendorf）。

1.2 材料

靈芝孢子粉（北京協(xié)和藥廠）；環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)）；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的CD3+（FITCCD3+），藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的CD8+（PE-CD8+），藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）-菁類染料（cyanine，Cy5）偶聯(lián)標記的CD4+（PE-CY5-CD4+）（美國BD）；RPMI-1640細胞培養(yǎng)液，胎牛血清（美國Gibco）；紅細胞裂解液（碧云天）；噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT），刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（美國Sigma Aldrich）；小鼠免疫球蛋白IgG、IgM ELISA試劑盒（武漢華美）。

1.3 動物

KM小鼠（SPF級），雄性，30～32 g[北京斯貝福實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002]。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院藥物研究所實驗動物中心（No. 00000804），自由攝食飲水，室溫22±1 ℃，相對濕度55～65%，12 h光照周期。所有動物的飼養(yǎng)和實驗過程均按照中國醫(yī)學科學院藥物研究所實驗動物倫理委員會的指導方針。

2 方法

2.1 靈芝孢子粉處理

準確稱取30 g靈芝孢子粉，加400 ml水，用破壁調(diào)理機處理，轉(zhuǎn)速10級，時間20 s/次，共4次。準確稱取30 g靈芝孢子粉，加400 ml水，用料理機處理，默認轉(zhuǎn)速，時間20 s/次，共4次。分別得破壁靈芝孢子粉混懸液和非破壁靈芝孢子粉混懸液。

2.2 破壁與非破壁靈芝孢子粉離心后沉淀重量比較

離心管稱重，分別加入破壁及非破壁處理的靈芝孢子粉混懸液5 ml，稱重，1000 r/min離心10 min，棄上清，再次稱重，計算沉淀重量。

2.3 化合物檢測

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫30 ℃，進樣量10 μl，檢測波長288 nm，流動相為0.02%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），采用負離子檢測模式，分別采用全掃描模式和單離子監(jiān)測模式對潛在化合物靈芝酸A、C2、D進行預測。

質(zhì)譜檢測參數(shù)為碎裂電壓150 V，增益1.5，干燥氣流速度10.0 L/min，噴霧氣壓力35 psig，干燥氣溫度350 ℃，毛細管電壓 3000 V（正模式），3000 V（負模式）。單離子監(jiān)測模式監(jiān)測的m/z見表2。

表2 單離子監(jiān)測模式檢測的離子m/z和對應的目標化合物

2.4 模型制備及分組

昆明小鼠80只，隨機分為正常對照組、模型組、非破壁靈芝孢子粉組（750 mg/kg）和破壁靈芝孢子粉組（750 mg/kg）。除正常對照組外其余3組腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，連續(xù)注射3 d。從第4天起開始給藥，各給藥組每天灌胃給予相應的藥物溶液，10 ml/kg，每天1次，連續(xù)28 d。正常對照組和模型組給予等容積的滅菌水。

2.5 自主活動測定

將小鼠放入自主活動箱中，測定前每只小鼠先適應環(huán)境1 min，再由記錄儀自動記錄3 min內(nèi)小鼠自發(fā)活動次數(shù)。

2.6 免疫球蛋白及T細胞亞群測定

采用ELISA法測定血清IgG和IgM水平。每只小鼠取全血樣50 μl，加入紅細胞裂解液500 μl，然后輕輕吹打均勻，2 min后800 r/min離心5 min，棄去上層紅色液體，離心洗滌兩次。加入50 μl生理鹽水重懸后分別加入CD3+、CD4+、CD8+抗體各1 μl，室溫下避光靜置15 min，加入450 μl生理鹽水輕吹混勻，上流式細胞儀檢測。

2.7 骨髓有核細胞計數(shù)測定

取小鼠一側(cè)完整股骨，除凈軟組織，用PBS將全部骨髓沖洗至離心管，過200目細胞篩，定容至5 ml。計數(shù)板計數(shù)，并計算絕對數(shù)量[7]。

2.8 免疫器官指數(shù)及淋巴細胞增殖的測定

無菌取脾和胸腺，清洗血跡并吸干水分，稱重，計算臟器指數(shù)。置于2 ml RPMI-1640細胞培養(yǎng)液中，200目細胞篩中研磨，收集細胞，后加入10 ml PBS，1000 r/min離心10 min，重復兩次。棄去上層溶液，加入6 ml紅細胞裂解液，吹打均勻，1500 r/min離心10 min，棄去上層溶液。加3 ml RPMI-1640細胞培養(yǎng)液，吹打均勻。以含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，鋪96孔板。設(shè)置加刺激組和對照組，刺激組加入ConA（終濃度為5 μg/ml）或LPS（終濃度為10 μg/ml），對照組加入等體積RPMI-1640細胞培養(yǎng)液。48 h后MTT染色，計算T淋巴細胞和B淋巴細胞相對增殖指數(shù)。

2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

3 結(jié)果

3.1 破壁與非破壁處理靈芝孢子粉離心后沉淀物重量比較

破壁靈芝孢子粉的沉淀重量較不破壁靈芝孢子粉的沉淀重量輕（P＜0.05），表明經(jīng)破壁處理的靈芝孢子粉有更多物質(zhì)混懸到溶液中，導致其沉淀重量較輕，見表3。

表3 破壁與非破壁處理靈芝孢子粉懸液離心后沉淀重量比較（±s，n=6）

表3 破壁與非破壁處理靈芝孢子粉懸液離心后沉淀重量比較（±s，n=6）

注：*P＜0.05 vs 非破壁組

非破壁/mg 破壁/mg 1180.7±141.1 1012.7±59.6*

3.2 HPLC-MS比較破壁與非破壁靈芝孢子粉中化合物含量差別

結(jié)果見表4。由表4可見，破壁靈芝孢子粉中靈芝酸A、C2、D的釋放量顯著高于非破壁靈芝孢子粉中的釋放量（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）。

表4 破壁與不破壁靈芝孢子粉中靈芝酸A、C2、D相對含量比較（±s，n=6）

表4 破壁與不破壁靈芝孢子粉中靈芝酸A、C2、D相對含量比較（±s，n=6）

注：***P＜0.001 vs 非破壁組

非破壁組相對含量/% 破壁組相對含量/%靈芝酸A 98.41±4.96 116.54±3.47***靈芝酸C2 97.70±5.92 110.13±10.34***靈芝酸D 103.44±7.55 117.76±2.25***

3.3 靈芝孢子粉對小鼠存活率的影響

連續(xù)統(tǒng)計31 d內(nèi)各組小鼠死亡情況，模型動物死亡率為35%（7/20），非破壁靈芝孢子粉治療組動物死亡率為25%（5/20），破壁靈芝孢子粉治療組動物死亡率為20%（4/20），破壁與非破壁靈芝孢子粉組動物死亡率差異無統(tǒng)計學意義。

3.4 靈芝孢子粉對小鼠自主活動的影響

測定各組小鼠自主活動次數(shù)，結(jié)果見圖1，各組間差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 小鼠自主活動次數(shù)（n=10）

3.5 靈芝孢子粉對小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響

結(jié)果見表5。由表5可見，與正常組相比，模型組小鼠胸腺、脾萎縮變小，胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均顯著降低（P＜0.001，P＜0.001）。與模型組相比，破壁靈芝孢子粉給藥治療組胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.01）。非破壁靈芝孢子粉給藥治療組胸腺指數(shù)與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義。說明破壁靈芝孢子粉給藥治療能顯著提高免疫低下小鼠的胸腺指數(shù)，非破壁給藥組無此作用。兩個給藥治療組脾指數(shù)均有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。

表5 胸腺、脾臟指數(shù)（±s，n=6）

表5 胸腺、脾臟指數(shù)（±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 對照組；**P＜0.01 vs 模型組

胸腺指數(shù) 脾指數(shù)對照組 1.49±0.42 5.12±0.76模型組 0.66±0.27### 3.54±0.88###非破壁組（750 mg/kg） 0.89±0.29 3.71±0.56破壁組（750 mg/kg） 1.05±0.34** 3.94±0.86

3.6 破壁靈芝孢子粉增加小鼠骨髓有核細胞

結(jié)果見表6。由表6可見，與對照組比較，模型組股骨有核細胞絕對數(shù)值顯著降低（P＜0.001）。與模型組相比，破壁靈芝孢子粉給藥治療能顯著提高股骨有核細胞絕對數(shù)值（P＜0.05）。非破壁靈芝孢子粉給藥治療對骨髓有核細胞數(shù)無顯著影響。說明破壁靈芝孢子粉的治療作用優(yōu)于非破壁靈芝孢子粉。

表6 骨髓有核細胞絕對數(shù)值（ ±s，n=6）

表6 骨髓有核細胞絕對數(shù)值（ ±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 對照組；*P＜0.05 vs 模型組

骨髓有核細胞數(shù)（×106）對照組 13.18±1.81模型組 6.8±1.35###非破壁組（750 mg/kg） 8.57±0.86破壁組（750 mg/kg） 9.17±1.23*

3.7 靈芝孢子粉對小鼠淋巴細胞增殖的作用

結(jié)果見表7。由表7可見，與正常組相比，模型組的刺激指數(shù)均顯著降低（P＜ 0.001），即腹腔注射環(huán)磷酰胺能顯著抑制機體T、B淋巴細胞的增殖。與模型組相比，破壁與非破壁靈芝孢子粉治療均能顯著提高T淋巴細胞的增殖指數(shù)（P＜0.05，P＜0.05）。破壁靈芝孢子粉能顯著提高B淋巴細胞的增殖指數(shù)（P＜0.01）。非破壁靈芝孢子粉給藥治療對B淋巴細胞增殖指數(shù)無顯著影響。

表7 淋巴細胞增殖指數(shù)（±s，n=6）

表7 淋巴細胞增殖指數(shù)（±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 對照組；*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

T淋巴細胞增殖指數(shù) B淋巴細胞增殖指數(shù)對照組 0.8±0.09 0.38±0.03模型組 0.31±0.05### 0.1±0.03###非破壁組（750 mg/kg） 0.46±0.09* 0.15±0.03破壁組（750 mg/kg） 0.47±0.08* 0.19±0.06**

3.8 破壁靈芝孢子粉調(diào)節(jié)外周血中T細胞亞群

結(jié)果見表8。由表8可見，與正常對照組相比，環(huán)磷酰胺可顯著下調(diào)CD3+和CD4+T細胞亞群的比例（P＜0.001，P＜0.01），降低CD4+/CD8+T細胞比值（P＜0.001），上調(diào)CD8+T細胞亞群的比例（P＜0.01）。與模型組相比，破壁靈芝孢子粉給藥治療能顯著抑制CD3+、CD4+的降低（P＜0.001，P＜0.01），顯著降低環(huán)磷酰胺所致CD8+（P＜0.01）的升高，調(diào)節(jié)CD4+/CD8+T細胞比值（P＜0.01）。非破壁靈芝孢子粉給藥組CD3+的比例和CD4+/CD8+的比值均顯著低于破壁處理組（P＜0.01，P＜0.05）。

表8 外周血中T細胞亞群（ ±s，n=6）

表8 外周血中T細胞亞群（ ±s，n=6）

注：##P＜0.01，###P＜0.001 vs 對照組；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs 模型組；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs 破壁組

CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+對照組 72.19±5.23 64.52±5.06 19.77±1.01 3.26±0.90模型組 53.52±4.49### 43.39±5.50## 30.41±2.00## 1.44±0.48###非破壁組（750 mg/kg） 56.83±4.04&& 50.87±6.73 26.15±3.56 1.95±0.52&破壁組（750 mg/kg） 66.13±4.25*** 61.32±3.59** 21.78±1.74** 2.83±0.24**

3.9 破壁靈芝孢子粉增加血清中IgG和IgM的含量

結(jié)果見表9。由表9可見，環(huán)磷酰胺模型組小鼠血漿免疫球蛋白IgG和IgM水平均顯著低于對照組（P＜0.001，P＜0.001）。與模型組相比，非破壁靈芝孢子粉能提高小鼠血清中IgM的含量（P＜0.05），對小鼠血清中IgG含量沒有明顯影響。破壁靈芝孢子粉治療組能顯著提高IgG（P＜0.05）和IgM（P＜0.01）的水平。

表9 血清中免疫球蛋白IgG和IgM的含量（±s，n=6）

表9 血清中免疫球蛋白IgG和IgM的含量（±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 對照組；*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

IgG IgM對照組 1297.5±236.18 615.67±35.46模型組 602.33±244.57###309.67±64.49###非破壁組（750 mg/kg） 882.8±128.2 414.27±65.05*破壁組（750 mg/kg） 925.19±93.35* 468.49±80.16**

4 討論與結(jié)論

靈芝孢子有兩層耐酸堿的堅硬壁狀結(jié)構(gòu)，只有經(jīng)過破壁的靈芝孢子才利于人體吸收利用，發(fā)揮其藥理活性，尤其是免疫活性[3-4]。靈芝酸A、靈芝酸C2和靈芝酸D均是三萜類物質(zhì)，是靈芝中的主要活性化合物。但靈芝孢子的破壁目前除了工業(yè)化處理外，尚沒有簡易的方法，使靈芝孢子的應用受到限制，也導致大量靈芝孢子雖被使用，但沒有發(fā)揮相應作用。

本實驗結(jié)果表明，應用破壁機，可實現(xiàn)對靈芝孢子的破壁，使其釋放更多的營養(yǎng)物質(zhì)，其中破壁靈芝孢子粉中的靈芝酸A、靈芝酸C2和靈芝酸D均顯著高于非破壁靈芝孢子粉中的對應物質(zhì)。

免疫是指機體免疫系統(tǒng)識別自身與異己物質(zhì)，并通過免疫應答排除抗原性異物，以維持機體生理平衡的功能[8-9]。目前，人們普遍認為機體的健康狀況及壽命的長短與免疫功能息息相關(guān)。當機體免疫功能下降或受抑制時，不能有效地識別并清除突變的細胞及外來細菌、病毒等，腫瘤及感染性疾病發(fā)生率增高[10-12]。因此，提高自身免疫力成了人們關(guān)注的話題，開發(fā)安全的具有免疫增強作用的功能性食品成為研究熱點[13-16]。

環(huán)磷酰胺是較強的烷化劑，可引起骨髓造血抑制和免疫抑制。實驗小鼠腹腔注射80 mg/kg環(huán)磷酰胺后，小鼠存活率顯著降低，免疫器官萎縮變小，股骨有核細胞絕對數(shù)值顯著降低，脾臟、胸腺的T、B淋巴細胞活性均受到不同程度抑制，且免疫球蛋白IgG和IgM含量降低。由此可見應用環(huán)磷酰胺腹腔注射小鼠造成免疫功能低下模型，可用來觀察不同破壁模式下靈芝孢子粉對免疫功能的影響。

連續(xù)28 d分別灌胃給予兩組實驗小鼠破壁靈芝孢子粉和非破壁靈芝孢子粉（750 mg/kg）。與模型組相比，破壁靈芝孢子粉給藥治療組能提高小鼠存活率，顯著提高小鼠胸腺指數(shù)，股骨有核細胞絕對數(shù)值顯著升高，且能顯著抑制環(huán)磷酰胺導致的T淋巴細胞及B淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化率的降低，顯著提高小鼠血漿免疫球蛋白IgG和IgM水平。與模型組相比，非破壁靈芝孢子粉給藥治療對小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、股骨有核細胞數(shù)、B淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化率、免疫球蛋白IgG均無顯著影響，僅能有效抑制環(huán)磷酰胺導致的T淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化率的降低、顯著提高小鼠血漿免疫球蛋白IgM水平。

T淋巴細胞主要介導細胞免疫，在體內(nèi)參與特異性免疫，它不僅是細胞免疫功能的承擔者，也是免疫應答的調(diào)節(jié)者。其中CD3+包括外周所有成熟T細胞，代表細胞免疫的總體水平[12,17]。CD4+細胞代表輔助/誘導性T細胞（Th），CD8+細胞代表抑制/殺傷性T細胞（Ts），二者在體內(nèi)維持一定的比例，共同參與免疫應答過程。本實驗中，磷酰胺可顯著下調(diào)CD3+和CD4+T細胞亞群的比例，降低CD4+/CD8+T細胞比值，上調(diào)CD8+T細胞亞群的比例。破壁靈芝孢子粉給藥治療組能調(diào)節(jié)免疫低下小鼠的淋巴細胞比例，對細胞免疫功能有恢復作用。

以上結(jié)果顯示，經(jīng)破壁處理的靈芝孢子粉對小鼠的免疫功能有較明顯的促進作用，與非破壁靈芝孢子粉相比，作用明顯增強。這為免疫力低下患者提供了一種行之有效的中藥有效成分食用方法。