馬德源，譚晴晴，陳力群，劉艷艷，葛付存，王佩儀，步 迅，陳雪燕，張全芳*

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100；2. 山東師范大學(xué)附屬中學(xué)，山東 濟(jì)南250014；3. 山東百味堂中藥飲片有限公司，山東 濟(jì)南 250108；4. 山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥有限公司，山西 晉中030800）

關(guān)鍵字：五靈脂；復(fù)齒鼯鼠；特異性；PCR；分子鑒定

要求，且相對(duì)誤差大。DNA基因鑒定近年在中藥鑒定中應(yīng)用較為廣泛,該技術(shù)能從基因?qū)用骅b別藥材,準(zhǔn)確性較高[6]，而DNA條形碼鑒定技術(shù)作為新興的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)，在中藥材領(lǐng)域取得豐碩成果[7]。COI 為線粒體基因組的蛋白質(zhì)編碼基因，全稱為細(xì)胞色素 C 氧化酶亞基 I（cytochrome C oxidase subunit I），由于該基因進(jìn)化速率較快，常用于分析親緣關(guān)系密切的種、亞種及地理種群之間的系統(tǒng)關(guān)系。陳士林等[8]在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上提出了以COI基因?yàn)橹?、ITS2基因?yàn)檩o的動(dòng)物類藥材DNA條形碼鑒定體系。由于五靈脂屬?gòu)?fù)齒鼯鼠的干燥糞便，放置時(shí)間較長(zhǎng)，DNA含量少，提取相對(duì)困難。利用動(dòng)物通用引物COI序列進(jìn)行鑒定，部分物種會(huì)出現(xiàn)不同程度套峰，致使檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，且PCR擴(kuò)增困難。本研究以五靈脂為研究對(duì)象，針對(duì)不同物種間序列差異性，利用線粒體16S rDNA基因片段對(duì)樣本五靈脂為復(fù)齒鼯鼠（Trogopterus xanthipes）的干燥糞便，始載于《開寶本草》，云：“出北地。此是寒號(hào)蟲糞也”[1]。五靈脂性味甘溫，無(wú)毒，入肝經(jīng)，具有疏通血脈、散瘀止痛的功效，主治血滯、經(jīng)閉、腹痛、胸脅刺痛跌撲腫痛和蛇蟲咬傷等癥，是婦科要藥[2]。然而，市場(chǎng)上部分藥材存在摻假問(wèn)題，如用紅白鼯鼠、飛鼠科動(dòng)物小飛鼠和黑白飛鼠、鼠兔科多種鼠兔的糞便冒充復(fù)齒鼯鼠的糞便，甚至部分不法分子利用小糞粒和沙粒及松樹葉碎片偽制成靈脂塊。這些偽品在外觀和質(zhì)地上都與真正的五靈脂極其相似，形態(tài)鑒別困難。

目前，對(duì)五靈脂真?zhèn)蔚蔫b別主要通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定和有效成分檢測(cè)鑒定。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定采用生藥鑒別和顯微鏡檢技術(shù)[3]，有效成分鑒定主要應(yīng)用薄層色譜鑒別技術(shù)[4]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)[5]。這些傳統(tǒng)方法對(duì)樣品的完整度和干燥度有一定進(jìn)行研究，通過(guò)分析比對(duì)相關(guān)序列，設(shè)計(jì)五靈脂特異性引物，旨在建立一種適用于中藥材五靈脂動(dòng)物基源成分鑒定的新分子標(biāo)記方法。

表1 樣品來(lái)源

1 儀器與材料

1.1 儀器

艾本德5333 PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Eppendorf）；ABI 3700XL DNA測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）；5810多功能臺(tái)式離心機(jī)離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；ChemiDoc? XRS+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.2 材料

本研究所用的試驗(yàn)樣品具體來(lái)源和信息見表1。市售的15個(gè)待測(cè)樣品購(gòu)自濟(jì)南某中藥市場(chǎng)。OMEGA Stool DNA 試劑盒（OMEGA公司）；Taq DNA聚合酶，10×緩沖液， dNTP [寶生物（大連）]。

2 方法

2.1 DNA樣品提取

針對(duì)糞便DNA提取困難的特點(diǎn)，本試驗(yàn)采用3種方法提取五靈脂基因組DNA，并進(jìn)行比較。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗樣品2～3遍，加核酸裂解液消化，取上清，酚-氯仿抽提，然后分別按方法A、B、C處理。方法A[9]：向沉淀中加入 CTAB裂解液500 μl和蛋白酶K20 μl，混勻，55 ℃裂解2 h；12 000 r/min離心5 min，上清置入1.5 ml離心管，加等體積氯仿抽提，混勻，12 000 r/min離心10 min，反復(fù)抽提兩次（離心后使水相和有機(jī)相之間不再有沉淀）；向上清中加0.1倍體積的3 mol/L醋酸鈉，1.5倍預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻，-20 ℃放置30 min；12 000 r/min離心10 min，棄上清，室溫干燥；向沉淀中加異硫氰酸胍洗液1 ml，搖勻至沉淀完全溶解；加硅珠懸液20 μl，緩慢振搖吸附DNA10 min，12 000 r/min離心1 min，棄上清；加70%乙醇700 μl重復(fù)洗滌沉淀2次；離心棄上清，56 ℃干燥10 in，加雙蒸水40 μl洗脫DNA，離心后將上清置入新的離心管，-20 ℃保存待用。方法B[10]：向沉淀中加CTAB裂解液700 μl和蛋白酶K 20 μl，混勻，56 ℃裂解2 h；12 000 r/min離心10 min，上清置入1.5 ml離心管，加等體積氯仿抽提，混勻，12000 r/min離心10 min，反復(fù)抽提兩次（離心后使水相和有機(jī)相之間不再有沉淀）；加2倍體積的DNA結(jié)合液和10 μl硅珠懸浮液，12000 r/min離心1 min；棄上清，加70%無(wú)水乙醇700 μl洗滌2遍；12000 r/min離心1 min，棄上清，56℃干燥10 min，加雙蒸水 40 μl洗脫DNA，離心后將上清置入新的離心管，-20℃保存待用。方法C參考動(dòng)物糞便提取試劑盒（OMEGA Stool DNA 試劑盒），具體操作步驟參照使用說(shuō)明書。每份DNA樣品分別取2 μl，用紫外線分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及A260、A280。每個(gè)樣品做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取均值。并利用動(dòng)物COI通用引物檢測(cè)DNA質(zhì)量。

2.2 引物設(shè)計(jì)

選擇復(fù)齒鼯鼠的線粒體16S rRNA基因作為研究對(duì)象，在Genbank中查找該基因序列（登錄號(hào)：AY227494.1）。采用Premier Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物，上游引物為Tr-16SF：5’-ACATTGACCTCTCCGTGAAGAG-3’，下游引物為Tr-16SR：5’-TTACACGATTTGGATGTCCTGAT-3’。通用引物COI序列擴(kuò)增正向引物 HCO2198：5’-TAA ACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’，反向引物L(fēng)CO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATT GG-3’。

2.3 PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)擴(kuò)增條件和體系參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。PCR擴(kuò)增采用25 μl體系，其中包括：10×Taq Buffer 2.5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μl，DNA模板2.0 μl，雙蒸水補(bǔ)足至25 μl。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，取5.0 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照保存。

2.4 特異性引物檢測(cè)

分別以從8份五靈脂、小家鼠糞便、黑白飛鼠糞便、紅白鼯鼠、紅耳鼠兔糞便和家兔糞便中提取的基因組DNA為模板，按2.3項(xiàng)優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其Tr-16SF/R引物的特異性。

2.5 靈敏度檢測(cè)

對(duì)所提取的五靈脂的DNA模板進(jìn)行質(zhì)量濃度測(cè)定，確定DNA濃度為44.35 ng/μl，按10倍梯度進(jìn)行稀釋（100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5），對(duì)所稀釋的DNA模板采用相同的PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)Tr-16SF/R引物的靈敏度。

2.6 數(shù)據(jù)分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用3730XL測(cè)序儀測(cè)序，然后將上下游序列通過(guò)Seq Man軟件進(jìn)行拼接，拼接結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)判斷檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.7 實(shí)際樣本檢測(cè)

利用本研究建立的PCR反應(yīng)體系和條件對(duì)15份待測(cè)樣本進(jìn)行特異性檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 3種方法提取的基因組DNA純度和濃度檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果見表2。由表2可見，方法B提取的DNA純度、濃度均優(yōu)于其他兩種方法。

表2 3種方法提取的基因組DNA純度和濃度檢測(cè)結(jié)果

3.2 COI通用引物檢測(cè)DNA模板質(zhì)量

圖1 COI通用引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)圖

利用COI通用引物對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。通用引物可擴(kuò)增出一條約700 bp條帶，見圖1。由圖1可見，提取的DNA質(zhì)量均能達(dá)到擴(kuò)增要求，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

3.3 PCR擴(kuò)增體系建立

對(duì)收集到的8個(gè)五靈脂樣品進(jìn)行特異性PCR檢測(cè)，以無(wú)菌水和鼠屬偽品作為陰性對(duì)照，見圖2。結(jié)果顯示，五靈脂為陽(yáng)性，擴(kuò)增出預(yù)期340 bp左右的條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果見圖3。擴(kuò)增序列拼接后進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示所擴(kuò)增的序列與復(fù)齒鼯鼠的相似度99%，說(shuō)明本方法能快速檢測(cè)出五靈脂。

圖2 五靈脂特異性引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖

圖3 五靈脂特異性引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序序列峰圖

3.4 特異性檢測(cè)

對(duì)收集到的13份樣品，按建立的特異性PCR方法進(jìn)行鑒別，結(jié)果見圖4。由圖4可見，1～8號(hào)有擴(kuò)增條帶，且非常清晰，純度較高，鑒定為正品五靈脂；其他樣品無(wú)條帶，擴(kuò)增結(jié)果為陰性，鑒定為非五靈脂正品。

圖4 五靈脂特異性驗(yàn)證電泳檢測(cè)圖

3.5 靈敏度檢測(cè)

靈敏度檢測(cè)結(jié)果見圖5。由圖5可見，當(dāng)DNA模板濃度稀釋至4.43 ng/μl時(shí)，特異性條帶擴(kuò)增明顯且單一，當(dāng)DNA濃度稀釋至0.443 ng/μl時(shí)，能微弱地看出擴(kuò)增條帶但相對(duì)模糊，之后的稀釋模板均無(wú)擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。由此說(shuō)明五靈脂特異引物的檢測(cè)靈敏度達(dá)4.43 ng/μl。

圖5 五靈脂特異性引物靈敏度檢測(cè)圖譜

3.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)15份待測(cè)樣本進(jìn)行特異性PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，10份樣本檢測(cè)出復(fù)齒鼯鼠源性，5份樣本未檢出復(fù)齒鼯鼠源性成分，見圖6。

圖6 市場(chǎng)盲樣檢測(cè)凝膠電泳圖

4 討論

五靈脂是糞便類中藥材，由于保存時(shí)間長(zhǎng)短不一且DNA降解嚴(yán)重，陳舊的糞便很難提取到高質(zhì)量的DNA，而DNA提取的質(zhì)量直接影響到后續(xù)PCR擴(kuò)增及相關(guān)分子檢測(cè)工作。由于糞便的干燥程度不同，提取過(guò)程中無(wú)法通過(guò)刮取表面黏稠層，洗脫表面表皮細(xì)胞進(jìn)行提取，只能將糞便搗碎混勻，吸取少量的樣品進(jìn)行DNA提取。通過(guò)這種方法收集的細(xì)胞很少，且?guī)в写罅康碾s質(zhì)。目前對(duì)于糞便提取常用的方法有試劑盒法、常規(guī)提取法、Chelex-100煮沸法和硫氰酸胍裂解法[11]。本研究根據(jù)五靈脂的特點(diǎn)，在DNA提取前先用PBS沖洗2～3次，直至沖洗液顏色變淺，從提取的基因組DNA濃度看，方法B的提取濃度高于方法A和C，且純度高，能很好地?cái)U(kuò)增出目的片段，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。同時(shí)，方法B相對(duì)于方法A、C耗時(shí)較短且操作簡(jiǎn)單。方法A雖然也能獲取較高濃度的基因組DNA，但耗時(shí)較長(zhǎng)，方法C屬于試劑盒提取，試劑費(fèi)用相對(duì)較高。五靈脂在干燥或成粉末后特征不明顯，通過(guò)傳統(tǒng)方法很難鑒定。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基源鑒定成為中藥標(biāo)準(zhǔn)化和重要研究的基礎(chǔ)[12]。本研究結(jié)果表明，引物Tr-16SF/R對(duì)五靈脂的檢測(cè)有較強(qiáng)的特異性，應(yīng)用該引物可實(shí)現(xiàn)其近緣物種快速準(zhǔn)確鑒別，且不受材料完整度、干燥程度的影響。