劉 夢(mèng)，林 強(qiáng)

（北京聯(lián)合大學(xué)，北京 100191）

憂遁草為爵床科（Acanthaceae）鱷嘴花屬鱷嘴花Clinacanthus nutans(Burm. F.) Lindau 的全草。別名千里追、柔刺草、漢帝草、沙巴蛇草，印尼民眾稱之為Sambung nyawa。主要分布于中南半島、馬來(lái)半島以及我國(guó)的南部和西南部。有報(bào)道稱2011年因馬來(lái)西亞某癌癥患者服用憂遁草后康復(fù)，于是憂遁草的藥用價(jià)值獲得關(guān)注。研究表明，憂遁草有良好的抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)的生物活性[1-4]，其中黃酮碳苷類物質(zhì)有降血糖、防輻射、抗菌殺蟲(chóng)、抗病毒及對(duì)肝臟心腦血管的保護(hù)多種生理活性[5]。黃丹民[6]研究憂遁草中黃酮碳苷類化合物發(fā)現(xiàn)，夏佛塔苷是憂遁草中含量最高的黃酮類化合物，并將其含量作為憂遁草質(zhì)量控制的指標(biāo)。人工種植的憂遁草由于環(huán)境和氣候變化，其主要成分將有較大變化。本文檢測(cè)國(guó)產(chǎn)和印度尼西亞兩種憂遁草中夏佛塔苷含量，以此為中藥和保健食品開(kāi)發(fā)選材及不同地區(qū)選材標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），Adventurer AR1140電子天平（奧豪斯，精密度萬(wàn)分之一），Christ Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī)（德國(guó)CHRIST公司），Rotavapor R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCH公司I），KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）。

1.2 試藥

甲醇為色譜純，色譜醇、雙蒸水均經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾。夏佛塔苷對(duì)照品（livingbio，批號(hào)：170413，純度≥98%），憂遁草樣品（中國(guó)海南人工種植，印度尼西亞巴芝丹人工種植）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 取10 mg夏佛塔苷對(duì)照品，用50%甲醇溶解定容至25 ml量瓶，配成0.4 mg/ml夏佛塔苷對(duì)照品溶液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾備用。

圖1 對(duì)照品和供試品色譜圖

2.1.2 供試品溶液 取國(guó)產(chǎn)憂遁草、印度尼西亞憂遁草各3 g，分別用60 ml 50%甲醇溶解，超聲提取30 min，旋蒸濃縮，凍干稱重。取適量的凍干粉末溶于2 ml 50%甲醇溶液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾備用。

2.2 色譜條件

采用Diamonsil C18(2)色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A相為0.1%乙酸水溶液，B相為甲醇，等度洗脫：0～60 min 24% B，流速1 ml/min, 柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)272 nm。在上述色譜條件下對(duì)照品及供試品的色譜圖見(jiàn)圖1（橫坐標(biāo)為出峰時(shí)間，縱坐標(biāo)為吸光度）。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液15，20，25，30，35，40 μl，按上述條件分別注入液相色譜儀測(cè)定，以夏佛塔苷含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y= 1 874 481X– 635 065，R2=1 。結(jié)果表明，夏佛塔苷在5.88～15.68 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液25 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得夏佛塔苷的峰面積RSD為0.26%，結(jié)果表明，進(jìn)樣精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取國(guó)產(chǎn)憂遁草提取物0.0148 g，用2 ml 50%甲醇溶解，濾膜過(guò)濾，分別在室溫放置0，2，4，8，12，16，24 h，進(jìn)樣測(cè)定夏佛塔苷峰面積。峰面積RSD為1.49%。結(jié)果表明，供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取適量國(guó)產(chǎn)憂遁草提取物6份，用2 ml 50%甲醇溶解，濾膜過(guò)濾，在上述色譜條件下進(jìn)樣25 μl，測(cè)定夏佛塔苷含量，結(jié)果表明，夏佛塔苷平均含量為9.99 mg/g，其RSD為0.13%。

2.7 加樣回收試驗(yàn)

取6份已知含量的國(guó)產(chǎn)憂遁草提取物，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品溶液（濃度為0.4 mg/ml）2 ml，按2.2項(xiàng)下方法，依次測(cè)定夏佛塔苷的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品測(cè)定

取國(guó)產(chǎn)憂遁草和印度尼西亞憂遁草提取物適量，用50%甲醇溶解，用濾膜過(guò)濾，制備2份供試品溶液，按2.2項(xiàng)下方法，依次測(cè)定夏佛塔苷的含量，采用外標(biāo)法計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中夏佛塔苷含量的測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

比較甲醇-水、乙腈-水等流動(dòng)相。結(jié)果表明，甲醇-水系統(tǒng)對(duì)憂遁草樣品的分離效果最好，甲醇-水系統(tǒng)夏佛塔苷峰拖尾嚴(yán)重，峰型差，可能因?yàn)橄姆鹚战Y(jié)構(gòu)中含有較多的醇羥基和酚羥基，羥基電離影響了分離效果，加入乙酸起到離子對(duì)抑制作用，峰型較優(yōu)[7]。通過(guò)等度洗脫和梯度洗脫的比較發(fā)現(xiàn)等度洗脫可以使憂遁草樣品達(dá)到較好的分離效果，經(jīng)過(guò)多次嘗試，最后選用等度洗脫。

3.2 波長(zhǎng)的選擇

對(duì)夏佛塔苷對(duì)照品溶液掃描，發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長(zhǎng)在270 nm附近，參照《中國(guó)藥典》（2015年版）廣金錢(qián)草中夏佛塔苷的檢測(cè)波長(zhǎng)[8]，最后選擇272 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取溶劑的選擇

參考夏佛塔苷測(cè)定的文獻(xiàn)[9]，考察40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇提取效率，結(jié)果表明，50%和60%甲醇明顯優(yōu)于40%甲醇，綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本及毒性，最后選用50%甲醇提取。

4 結(jié)論

結(jié)果表明，國(guó)產(chǎn)憂遁草中夏佛塔苷的含量明顯地高于印度尼西亞產(chǎn)的憂遁草。夏佛塔苷作為一種已知的含量最多黃酮碳苷類化合物，其含量的高低直接影響到憂遁草的功效。但憂遁草中黃酮種類較多，其他黃酮成分的含量與功效還有待進(jìn)一步研究。有研究對(duì)馬來(lái)西亞Negeri Sembilan，Johor和Perak三個(gè)地區(qū)的憂遁草中四種黃酮碳苷類化合物的含量[10]，其中夏佛塔苷的含量均低于國(guó)產(chǎn)憂遁草，國(guó)產(chǎn)和印尼憂遁草的功效高低還需進(jìn)一步研究。