趙華龍，毛 涵,2，王遠(yuǎn)平，王 露，湯新慧*

（1. 鹽城師范學(xué)院 江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點建設(shè)實驗室, 江蘇 鹽城 224051；2. 南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院, 江蘇 南京 210009）

鳶尾（Iris tectorumMaxim）是一種傳統(tǒng)的藥用植物，屬天門冬目，鳶尾科多年生草本，味苦、辛，性冷，有小毒，多生長于坡地、林緣及水邊濕地，喜陽光充足的環(huán)境[1]。鳶尾的藥用歷史久遠(yuǎn)，《中華本草》記載[2]，鳶尾具有清熱解毒、祛風(fēng)利濕、消腫止痛等功效，可用于治療跌打損傷、風(fēng)濕疼痛、咽喉腫痛、食積腹脹、瘧疾等病癥，也可外用治癰癤腫毒、外傷出血。從鳶尾中分離出的多種天然產(chǎn)物中，黃酮類為其主要的化學(xué)成分。研究表明，鳶尾中發(fā)揮功效的主要有效成分為異黃酮[3]。鳶尾中含有豐富的異黃酮類，主要包括野鳶尾苷元、鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素等[4]，有廣泛的生物活性。近年，對于鳶尾屬植物中黃酮類成分的研究多集中于成分結(jié)構(gòu)及生物活性，全新的化合物和多樣的生物活性不斷被發(fā)現(xiàn)，其中擁有多種生理功能的異黃酮日益受到關(guān)注。Xie等[5]從屋頂鳶尾中分離出2種新的異黃酮類化合物Iriskashmirianin A和Germanaism H，并發(fā)現(xiàn)其能抑制埃利希腹水癌（EAC）細(xì)胞系增殖，有顯著的抗炎作用。Fang等[6]從鳶尾中分離出的異黃酮成分 Iritectol B和Iridobelamal A對人乳腺癌細(xì)胞（MCF7）和人惡性黑色素瘤細(xì)胞（C32）呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，顯示其一定的抗癌作用。Kang等[7]研究表明，鳶尾黃素 （tectorigenin）能通過激活ERK信號通路清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧和DPPH自由基，以防止脂質(zhì)過氧化。然而目前對于鳶尾異黃酮是否具有抗菌作用鮮有報道。

鳶尾異黃酮的提取多集中于根莖，鳶尾葉中也含有豐富的異黃酮成分，開發(fā)鳶尾葉的價值有助于鳶尾的充分利用。本實驗以鳶尾葉為原料，以醇提法提取鳶尾葉中的總黃酮，采用硅膠柱色譜結(jié)合高效液相色譜法對鳶尾異黃酮進(jìn)行分離純化和含量測定[8]，確定鳶尾異黃酮的最佳分離純化工藝及含量測定條件，并考察鳶尾異黃酮體外抗菌活性，以期為鳶尾藥用價值的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

野生鳶尾，采集于江蘇省鹽城市沿海灘涂，經(jīng)鹽城師范學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院孫同興教授鑒定為鳶尾科鳶尾屬鳶尾（Iris tectorumMaxim.）全草；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（江蘇省康華醫(yī)藥科技實業(yè)中心）；鳶尾苷對照品（純度≥98%，德思特生物）；硅膠（試劑級，300～400目，煙臺新諾）；甲醇：色譜純，其他試劑均為分析純。

UltiMate 3000高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific）；IKA RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（艾卡儀器設(shè)備）；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機（寧波新芝生）； UV-2000紫外分析儀（上海嘉鵬科技）；KQ-100DB數(shù)控超聲波提取儀（昆山超聲儀器）。

1.2 鳶尾異黃酮制備方法

鳶尾葉洗凈，干燥，打磨成粉，稱取鳶尾葉干粉10 g，以料液比1:25加入85%乙醇溶液溶解，置于超聲波提取儀超聲50 min，功率90 W。重復(fù)提取3次，抽濾，合并濾液。真空濃縮至約350 ml，加入等體積石油醚萃取，至石油醚無色，合并萃取液，繼續(xù)真空濃縮至浸膏，移入冷凍干燥機內(nèi)凍干，稱重，得鳶尾異黃酮粗提物[9]。

1.3 鳶尾異黃酮分離純化方法

1.3.1 柱層析洗脫劑的選擇 以85%乙醇為溶劑[10]，將粗提物干粉定容至10 ml，混勻，制備鳶尾黃酮粗品醇溶液。分別以85%乙醇、乙酸乙酯-丙酮-無水乙醇（5:1:0.5）和乙酸乙酯-甲醇-甲酸（5:2:1）為展開劑在硅膠G板上定距8 cm展開，以鳶尾苷作為對照品，265 nm波長紫外分析儀下顯色，觀察展開效果，選擇合適洗脫劑。

1.3.2 硅膠柱層析分離純化 采用濕法裝柱，稱取硅膠粉末20 g，洗脫劑浸泡30 min。取直徑2.5 cm，柱長40 cm層析柱豎直固定，關(guān)閉底部活塞，將硅膠沿玻璃棒裝入層析柱內(nèi)，待硅膠自然沉降，排出洗脫劑，輕輕敲打柱壁使硅膠沉積壓實。取1 ml樣品溶液，沿層析柱內(nèi)壁緩慢均勻加入，樣品層上加一層脫脂棉輕輕壓實。洗脫劑進(jìn)行洗脫，每10 ml收集一份，依次編號。薄層層析（TLC）法檢測收集的各管洗脫液，合并含鳶尾異黃酮的洗脫液。

1.4 鳶尾異黃酮含量和純度測定

1.4.1 HPLC色譜條件 取適量鳶尾苷對照品和鳶尾異黃酮樣品用色譜甲醇定容至10 ml，0.45 μm微孔濾膜過濾制得對照品和樣品溶液。使用C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流動相A為甲醇，B為0.4%磷酸，以A:B = 90:10（v/v）進(jìn)行洗脫，流速1 ml/min，進(jìn)樣量20 μl，檢測波長為265 nm。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取鳶尾苷對照品溶液20 μl 進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積，以對照品濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 鳶尾異黃酮抑菌試驗

精密稱取純化后的鳶尾異黃酮配制濃度為0.625，1.25，2.5，5 mg/ml的樣品溶液。分別以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌作為指示菌，制備指示菌菌液，各吸取200 μl加至LB培養(yǎng)基平板涂布均勻，含菌濃度約l06cfu/ml。在平板上放置牛津杯，分別加入各組樣品100 μl，空白樣品作為對照，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑[11]，每組設(shè)置3個平行實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品分離純化

根據(jù)鳶尾異黃酮易溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、甲酸等有機溶劑的極性，配制合適比例的洗脫劑。鳶尾異黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)是以3-苯基苯并吡喃酮為母體的多羥基酚類，與雌二醇結(jié)構(gòu)相似，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等極性溶劑，基本不溶于水[12]。故分別設(shè)置85%乙醇（洗脫劑I）、乙酸乙酯:丙酮:無水乙醇=5:1:0.5（v/v/v）（洗脫劑II）、乙酸乙酯:甲醇:甲酸=5:2:1（v/v/v）（洗脫劑III），TLC法對鳶尾異黃酮粗品溶液進(jìn)行展開分析。結(jié)果表明，洗脫劑I展開拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重，且各組分不能充分展開。洗脫劑II和洗脫劑III（圖1 A）對鳶尾異黃酮均有一定展開效果，且展開的各組分中有與對照品處于同一位置的斑點；其中洗脫劑II的展開效果較好，各條帶分離較明顯，故作為柱層析洗脫劑對鳶尾異黃酮進(jìn)行分離純化。

圖1 鳶尾異黃酮薄層色譜圖

以洗脫劑II對鳶尾總黃酮進(jìn)行洗脫，洗脫組分分別用25 ml錐形瓶收集，每瓶10 ml，依次編號。洗脫結(jié)束后取1，2，4，7，9，11，13，15，17，19，22，24，26，29，31，34，37，40號收集液進(jìn)行TLC分析，結(jié)果表明，4～19號收集液的薄層層析斑點與對照品斑點處于同一位置（圖1B），合并與對照品斑點處于同一位置的收集液，真空濃縮至干，稱重。

2.2 樣品含量及純度測定

2.2.1 線性關(guān)系考察 精密稱取2 mg鳶尾苷對照品溶于20 ml 70%乙醇溶液，分別取0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.9，1.0 ml定容至10 ml，搖勻，配制成系列濃度對照品溶液。以70%乙醇溶液為空白對照，在波長265 nm處測定吸光值，以鳶尾苷濃度為橫坐標(biāo)，各濃度吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得直線回歸方程Y=1.5855X+0.0141，R2=0.9794，RSD=1.05%（n=5），表明鳶尾苷濃度在1～100 μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

圖2 鳶尾異黃酮HPLC色譜圖

2.2.2 樣品制備與測定 采用面積歸一化法，測定鳶尾苷對照品的純度。精密稱取鳶尾苷對照品，用色譜甲醇配制濃度為0.1 mg/ml樣品溶液，根據(jù)實驗方法1.4.1中的HPLC色譜條件分析，結(jié)果表明，對照品為單峰（圖2A），保留時間為1.53 min，用面積歸一化法計算含量為99.76%，符合對照品含量測定使用要求。樣品HPLC分析結(jié)果顯示為單峰，保留時間1.55 min，與對照品基本一致（圖2B）。根據(jù)HPLC測定結(jié)果，計算樣品中鳶尾異黃酮的含量和純度。

結(jié)果見表1，鳶尾異黃酮在總黃酮粗提物中的含量為620 mg/ml，純度為15.28%，得率6.09%。純化后的鳶尾異黃酮含量為167.4 mg/ml，純度為91.29%，得率1.62%。

表1 鳶尾異黃酮含量和純度

2.3 抗菌活性

分別以革蘭陽性菌枯草芽孢桿菌和革蘭陰性菌大腸桿菌為指示菌，檢測不同濃度鳶尾異黃酮的抗菌活性。結(jié)果見表2。不同濃度的鳶尾異黃酮對枯草芽孢桿菌均有一定抑菌效果，而0.625 mg/ml鳶尾異黃酮對大腸桿菌無抑菌作用，隨著濃度增加，開始顯示出一定的抑菌效果。

表2 牛津杯法實驗結(jié)果

檢測各處理組的抑菌圈直徑，結(jié)果見表3。鳶尾異黃酮對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有一定程度抑制作用。鳶尾異黃酮對大腸桿菌最小抑菌濃度為1.25 mg/ml，對枯草芽孢桿菌最小抑菌濃度為0.625 mg/ml。

表3 不同濃度鳶尾異黃酮對不同菌種的抑制作用

3 討論

異黃酮是一種弱的植物雌激素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中B環(huán)連接于C3位上，分子間的作用力較大，導(dǎo)致脂溶性和水溶性較差，只能溶于一些有機試劑[15-17]。根據(jù)鳶尾異黃酮的這種結(jié)構(gòu)特性，筆者分別嘗試以不同比例的85%乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、甲醇、甲酸等成分配制柱層析洗脫劑，發(fā)現(xiàn)以乙酸乙酯:丙酮:無水乙醇= 5:1:0.5（v/v/v）為洗脫劑分離效果最佳，其他條件均會出現(xiàn)分離不充分或不同程度的拖尾現(xiàn)象。在HPLC檢測含量過程中，也探索了流動相。鳶尾中所含成分比較復(fù)雜，雖經(jīng)柱層析分離各成分，但也有可能仍有雜質(zhì)未充分分離，流動相不合適易造成出峰時間過長或分離效果不佳。筆者通過調(diào)節(jié)甲醇與0.4%磷酸比例，分別設(shè)置甲醇:0.4%磷酸比例50:50（v/v）、70:30（v/v）、80:20（v/v）、90:10（v/v）為流動相對樣品進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，以甲醇:0.4%磷酸=90:10（v/v）為HPLC流動相，樣品和對照品的峰型均為單峰，保留時間較為一致，分離效果較好。

藥物濃度是影響抑菌效果的重要因素之一。對半稀釋鳶尾異黃酮溶液建立濃度梯度樣品溶液，實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在0.625～5 mg/ml范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，鳶尾異黃酮分別對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌呈現(xiàn)出一定的抑制效果，當(dāng)樣品濃度大于5 mg/ml時，各濃度的抑菌圈之間會形成交叉，影響試驗結(jié)果的統(tǒng)計。而濃度小于0.625 mg/ml時，各抑菌圈之間并未呈現(xiàn)明顯的差異。同時，鳶尾異黃酮表現(xiàn)出對枯草芽孢桿菌更明顯的抑制作用，顯示其對革蘭陽性菌具有較為突出的抑菌效果。

綜上所述，本研究通過柱層析-高效液相色譜法得到純度較高的鳶尾異黃酮，通過抑菌試驗證實其具有顯著的抑菌活性，對于深入推廣和研究鳶尾的藥理作用具有一定的參考價值。