門 濤

精神分裂癥是臨床常見的受基因變異和環(huán)境影響的疾病，嚴(yán)重影響患者的身心健康，主要采用藥物治療。利培酮是第二代抗精神病藥物，其主要特點是對精神分裂癥患者的陰性或陽性癥狀均有較好的臨床療效，并且與傳統(tǒng)的抗精神病藥物相比，其引起錐體束外反應(yīng)的危險性較小[1]。利培酮的藥物動力學(xué)研究顯示，其體內(nèi)暴露劑量存在個體差異性，而單核苷酸突變可能是其個體差異的主要原因[2]。既往研究表明，CYP2D6和CYP3A5是利培酮體內(nèi)代謝的關(guān)鍵限速酶，因單核苷酸突變而出現(xiàn)的不同基因型攜帶者的利培酮濃度具有明顯差異[3-4]。國外已有報道CYP2D6*4、*6等基因型對于利培酮藥物代謝的影響，而在亞洲，CYP2D6*10和CYP3A5*3作為主要等位基因突變類型[5]，在與利培酮的臨床療效研究中較為少見。因此，本研究觀察CYP2D6和CYP3A5基因多態(tài)性聯(lián)合檢測對精神分裂癥患者服用利培酮藥物濃度的影響，旨在尋找能夠預(yù)測個體化服用利培酮藥物療效的生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2017年5月至2018年5月在營口市第四人民醫(yī)院精神科接受診治的精神分裂癥患者為研究對象，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國《精神障礙診斷與統(tǒng)計》第 5版中精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②治療期間未服用其他抗精神病藥物，僅服用利培酮治療且超過1周；③肝、腎功能無明顯異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有培酮藥物過敏和耐藥史；②妊娠期女性；③有藥物濫用史或吸毒史。最終納入83例患者，其中男41例，女42例，年齡23～58歲，平均（35±11）歲；平均體重指數(shù)（24±4）kg/m2。利培酮服藥方法為早晚各1次，每次2～5 mg。

1.2CYP2D6和CYP3A5基因多態(tài)性檢測每例患者服藥 1個月，血藥濃度達到穩(wěn)態(tài)后，于清晨空腹采集靜脈全血2 ml，EDTA-Na抗凝，采用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法提取全血樣本中的DNA，采用紫外分光光度法測定OD260和OD280值，保證其DNA純度為1.6～2.0。CYP2D6和CYP3A5基因多態(tài)性檢測相關(guān)試劑和引物設(shè)計由上海吉凱基因公司提供，CYP2D6引物序列：上游5，-GATGAAGGGATAAT GTGGTCC-3，下游5，-GGTCCAAACAGGGAAGA AATA-3，；CYP3A5引物序列：上游 5，-CTGTGG TAGCCACCCACCATCCAT-3，下游5，-TCAACAA CGCACGTTCACTCACAGCA-3。PCR反應(yīng)體系共25 μl，分別為 PCR 反應(yīng)液（10×）2.5 μl、Mg2+（100 mmol/L）1.5 μl、dNTP（20 mmol/L）0.5 μl、Taq 酶（5 U/μl）0.2 μl、Primer（5 pmol/L）0.4 μl、上下游引物各 1 μl、DNA 模版 1 μl、ddH2O 16.9 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，共35個循環(huán)，94 ℃變性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，最后72 ℃延伸8 min，4 ℃下保存1周。CYP3A5 PCR產(chǎn)物行酶切反應(yīng)，體系為305 μl，分別為限制性內(nèi)切酶 Sspl（5 U/μl）1 μl、Buffer 2 μl、PCR 產(chǎn)物 10 μl、ddH2O 17 μl?；靹蚝?7 ℃孵育5 h，后取酶內(nèi)切產(chǎn)物以及CYP2D6 PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測其基因多態(tài)性。CYP3A5 *1/*1基因多態(tài)性表現(xiàn)為148 bp、125 bp與 20 bp，*3/*3基為 168 bp和 125 bp，*1/*3為168 bp、148 bp、125 bp和20 bp。CYP2D6*1/*1基因多態(tài)性表現(xiàn)為433 bp和180 bp，*10/*10型為433 bp和290 bp，*1/*10型為433 bp、290 bp和180 bp。

1.3血漿利培酮與9-羥基利培酮測定采用液相色譜法進行檢查。取EDTA-Na抗凝全血血漿300 μl，加入15 μl內(nèi)標(biāo)液，混勻后再加入提取液1 ml，1500 r/min，離心5 min，吸取上層有機相，轉(zhuǎn)移至潔凈聚丙烯塑料管，于38 ℃下烘干，然后用100 μl 50%甲醇水溶液溶解，混勻后離心5 min（1500 r/min），最后取10 μl放入自動進樣管待測。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源、MRM掃描、Capcell PAK C18MG分析柱、含0.02%甲酸水溶液的流動相A、含0.02%甲酸乙腈溶液的流動相B、電壓1500 V、溫度450 ℃、梯度洗脫，流速為0.4 ml/min。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s表示，非參數(shù)檢驗比較采用 Mann-Whitney檢驗和 Kruskal-Wallis檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CYP2D6基因多態(tài)性和血漿利培酮與9-羥基利培酮的相關(guān)性分析血漿利培酮、9-羥基利培酮與總活性產(chǎn)物（利培酮+9-羥基利培酮）在CYP2D6*10/*10基因型中濃度均明顯高于*1/*1和*1/*10，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而在CYP2D6 *1/*1和*1/*10基因型中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。Spearman相關(guān)分析顯示，血漿利培酮、9-羥基利培酮、總活性產(chǎn)物和CYP2D6 *10/*10呈明顯正相關(guān)（r=0.756、0.773、0.812，P＜0.001）。

表1 CYP2D6基因多態(tài)性和血漿利培酮與9-羥基利培酮的相關(guān)性(ng/ml,±s)

表1 CYP2D6基因多態(tài)性和血漿利培酮與9-羥基利培酮的相關(guān)性(ng/ml,±s)

注：與*1/*1和*1/*10組比較，aP＜0.05

基因多態(tài)性 例數(shù) 利培酮 9-羥基利培酮 總活性物*1/*1 21 52±12 58±13 108±15*1/*10 36 79±16 80±17 159±32*10/*10 26 243±36a 290±35a 532±68a

2.2CYP3A5基因多態(tài)性和血漿利培酮與9-羥基利培酮的相關(guān)性分析血漿利培酮與總活性產(chǎn)物濃度在CYP3A5 3種基因型中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而9-羥基利培酮濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并且CYP3A5 *3/*3基因型中9-羥基利培酮濃度明顯高于*1/*1與*1/*3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。Spearman相關(guān)分析顯示，血漿9-羥基利培酮與CYP3A5 *3/*3呈明顯正相關(guān)（r=0.743，P＜0.05）。

2.3CYP2D6與CYP3A5聯(lián)合檢測CYP2D6*10/*10和CYP3A5*3/*3聯(lián)合檢測，與其單一純合子進行比較發(fā)現(xiàn)，血漿利培酮、9-羥基利培酮與總活性產(chǎn)物在*3/*3且*10/*10基因組中均明顯高于單一*3/*3或*10/*10，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表2 CYP3A5基因多態(tài)性和血漿利培酮與9-羥基利培酮的相關(guān)性研究(ng/ml,±s)

表2 CYP3A5基因多態(tài)性和血漿利培酮與9-羥基利培酮的相關(guān)性研究(ng/ml,±s)

注：與*1/*1和*1/*3組比較，aP＜0.05

基因多態(tài)性 例數(shù) 利培酮 9-羥基利培酮 總活性物*1/*1 25 89±15 218±31 306±35*1/*3 30 96±18 235±35 330±32*3/*3 28 123±22 317±42a 439±64 F值 265.5 235.5 270.0 P值 0.144 0.032 0.118

表3 CYP2D6與CYP3A5聯(lián)合檢測與血漿利培酮與9-羥基利培酮的相關(guān)性研究(ng/ml,±s)

表3 CYP2D6與CYP3A5聯(lián)合檢測與血漿利培酮與9-羥基利培酮的相關(guān)性研究(ng/ml,±s)

聯(lián)合檢查 例數(shù) 利培酮 9-羥基利培酮 總活性物*3/*3 且*10/*10 20 236±26 294±31 529±58*3/*3 或*10/*10 14 146±17 204±21 349±37 U值 112.5 121.0 105.5 P值 0.014 0.018 0.007

3 討論

精神分裂癥是一種體內(nèi)基因變異和生活環(huán)境共同作用下發(fā)生的一類具有遺傳傾向的疾病，流行病學(xué)研究顯示我國精神分裂癥的發(fā)病率約為 1%[7]，大多數(shù)患者預(yù)后不佳，給家庭和社會造成重大負擔(dān)。精神分裂癥目前主要采用口服藥物治療，利培酮是一種苯并異惡唑衍生物，也是一種新型的非傳統(tǒng)的抗精神病藥物，臨床上主要用于治療各種急、慢性精神分裂癥及精神病狀態(tài)下的相關(guān)臨床癥狀[8]，其主要活性成分是 9-羥利培酮，它是一種選擇性的單胺能拮抗劑，可在機體內(nèi)與 5-羥色胺能的 5-HT2受體和多巴胺能的D2受體結(jié)合，通過拮抗其生物學(xué)效益，可以有效緩解錐體外系副作用的發(fā)生，并且對精神分裂癥的陰性癥狀和情感障礙也有較好的改善作用[9]。同時，9-羥利培酮與多巴胺能受體的相互結(jié)合，可以明顯改善精神分裂癥的陽性癥狀，并且對運動功能的抑制作用及其相關(guān)強制性暈厥的發(fā)生率均低于傳統(tǒng)的抗精神病藥物[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，個體化藥物治療對環(huán)境的敏感性存在明顯的差異性，并且這種差異性取決于機體的不同基因型[11-12]。因此，目前臨床藥理研究中，不同患者服用利培酮可表現(xiàn)出不同的臨床療效和不良反應(yīng)，這些表現(xiàn)均受基因多態(tài)性的影響，研究和證實相關(guān)基因多態(tài)性對于利培酮臨床療效的影響和對患者安全用藥有極大的幫助[13]。CYP450酶系的諸多酶類分布于多種器官、組織上，參與多種生命活動，包括固醇類物質(zhì)合成、脂肪酸和激素的氧化分解、大多數(shù)藥物或外來物的生物氧化等，通過代謝解毒和代謝活化的作用參與機體的新陳代謝。CYP450基因的突變和多態(tài)性可以導(dǎo)致相應(yīng)酶的活性降低、升高、甚至是失活，酶活性的改變可能會導(dǎo)致個體服藥療效的差異[14]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，CYP2D6和CYP3A5是重要的CYP450酶系成員，同時發(fā)現(xiàn)CYP2D6是利培酮體內(nèi)代謝的主要限速酶[15]，其等位基因突變在亞洲人群主要以CYP2D6 *10基因型為主，是外顯子1第188位置堿基C變成T導(dǎo)致，從而會使蛋白表達的脯氨酸變成絲氨酸，導(dǎo)致其表達酶的活性降低，底物藥物的代謝活性也會相應(yīng)減弱[16]。本研究顯示，CYP2D6 *10/*10基因型中血漿利培酮、9-羥基利培酮與總活性產(chǎn)物濃度明顯高于*1/*1和*1/*10，提示CYP2D6突變型純合子*10/*10攜帶者的利培酮與9-羥基利培酮藥物代謝較慢，其體內(nèi)藥物濃度明顯高于突變型雜合子*1/*10和野生型純合子*1/*1，指導(dǎo)臨床醫(yī)師對于CYP2D6*10純合子攜帶者更加注意利培酮的用藥劑量，因為藥物代謝慢，患者不良反應(yīng)的發(fā)生率也較大。另外，CYP3A也參與了利培酮體內(nèi)代謝過程，特別是CYP3A5與 9-羥基利培酮代謝密切相關(guān)[17]。CYP3A5*3是由外顯子3的第6986堿基A變成G所致，會使9-羥基利培酮代謝活性減弱，本研究結(jié)果證實，CYP3A5*3突變純合子的9-羥基利培酮濃度明顯高于*1/*1和*1/*3。進一步分析CYP2D6和CYP3A5突變純合子聯(lián)合檢查的重要性，與單一突變純合子患者比較，血漿利培酮、9-羥基利培酮與總活性產(chǎn)物在*3/*3且*10/*10基因組中明顯增高，表明CYP2D6*10和CYP3A5*3純合子人群血漿利培酮代謝更加緩慢，臨床工作者要及時調(diào)整用藥劑量，在發(fā)揮藥物療效的同時，更要防止藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。