謝 軍，孫英杰，周昌孌，朱善元，丁 鏟*，柏家林

(1.西北民族大學生物工程與技術國家民委重點實驗室，蘭州 730030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.西北民族大學,甘肅省動物細胞工程技術研究中心，蘭州 730030；4.西北民族大學生命科學與工程學院, 蘭州 730030；5. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，泰州 225300)

禽流感(avian influenza，AI)是由A型流感病毒(influenza virus A)引起的禽類傳染疾病。禽流感病毒屬正黏病毒科流感病毒屬，單股、負鏈、分節(jié)段的RNA病毒[1]。禽流感病毒不僅可以感染野生鳥類、水禽和家禽，還感染人類及貓、豬、馬、老虎等哺乳動物[2-3]。AI可致家禽產(chǎn)生高達100%的發(fā)病率和死亡率，并可感染人和出生致死病例，對世界養(yǎng)禽業(yè)和人類健康構成嚴重威脅[4-5]。新城疫(Newcastle disease，ND)又稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的雞和火雞急性高度接觸性傳染病。新城疫病毒屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬，單股、負鏈、不分段的RNA病毒[6]。新城疫病毒主要是通過家禽個體間的直接傳播和通過呼吸道的飛沫或糞便等間接傳播方式傳播，其感染率和病死率可達100%[7]。禽流感和新城疫被世界動物衛(wèi)生組織列為必須報告的疾病，在我國被列為優(yōu)先防治的一類動物疫病[8-9]。

家禽養(yǎng)殖過程中，多種病毒混合感染情況普遍存在。2000—2006年我國4個主要養(yǎng)雞大省5種免疫抑制性病毒的流行病學調(diào)查結果顯示雞群中二重及多重混合感染的陽性率達31.73%，其中馬立克病毒(MDV)和雞傳染性貧血病毒(CIAV)、MDV和禽白血病病毒的二重感染陽性率最高[10]。中國、伊朗、巴基斯坦等國家自1997年均報道過H9N2弱毒AIV感染導致大量雞群死亡的事件，深入研究表明AIV與其他禽呼吸道疾病的共感染可能是導致雞群大規(guī)模死亡的原因[11-12]。Haghighat-Jahromi等[13]研究表明傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)與AIV共感染能夠顯著增強AIV病毒釋放，增強其致病性，導致雞群死亡。

AIV屬于正黏病毒科流感病毒屬，NDV屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬；副黏病毒與正黏病毒均是負鏈RNA病毒，其成熟病毒粒子均通過從細胞膜表面出芽釋放。AIV的核蛋白(nucleoprotein, NP)高度保守，在各亞型間的相似性達90%以上，是主要的型特異性抗原[12-13]。NDV的核蛋白對病毒基因組RNA及反基因組RNA的殼體包裹和病毒的復制至關重要。

全球范圍內(nèi)，野生水禽中多次檢測到NDV和AIV的共感染[14]。然而這兩種病毒共感染的機制、共感染病毒的復制和共感染的傳播途徑尚不明確。本試驗研究了NDV和H9N2亞型AIV體外共感染雞成纖維細胞DF-1對病毒復制的影響，為研究AIV和NDV共感染機制奠定了基礎，并為臨床上兩種病毒的防控提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1 毒株和細胞

新城疫病毒Chicken/NL/Herts/33毒株由揚州大學劉秀梵院士惠贈，禽流感病毒A/HongKong/1073/99(H9N2) 毒株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。雞成纖維細胞(DF-1)、犬腎細胞(MDCK)購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)。H9N2毒株和Herts/33毒株分別尿囊腔接種9日齡SPF雞胚，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后收集尿囊液，參照中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量規(guī)程[15]，用DF-1細胞和MDCK細胞計算Herts/33和H9N2的病毒滴度分別為106.5和104.7TCID50·mL-1。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清FBS購自美國Hyclone公司。兔源禽流感NP抗體(A01506-40)購自金斯瑞生物科技有限公司，β-actin單克隆抗體(monoclcnal anti-β-actin， A1978)購自美國Sigma公司；鼠源NDV-NP抗體由本實驗室制備。辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG購自美國Jackson Immuno Research公司；預染蛋白質(zhì)Marker購自NEB公司；NC膜購自GE公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自碧云天生物技術研究所；TRIzol購自Thermo Fisher公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；SYBR Premix ExTaqreagents購自TaKaRa公司；TBST為實驗室自行配制。

1.3 病毒感染

單獨感染組：DF-1細胞復蘇后盲傳數(shù)代后接種至6孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞長至80%～90%密度時，棄去培養(yǎng)基， DMEM稀釋1.0 MOI的NDV病毒液接種細胞，吸附1 h后棄上清，換1% FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，間隔4 h、共計6個時間點收取樣品，進行后續(xù)試驗。AIV感染DF-1細胞步驟同NDV，但在病毒吸附和維持過程中在培養(yǎng)基中加入TPCK胰酶至終濃度1 μg·mL-1。

共感染組：復蘇培養(yǎng)的DF-1盲傳數(shù)代后接種至6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞長至80%～90%密度時，棄去培養(yǎng)基。根據(jù)單獨感染組1.0 MOI所需病毒含量，用不含F(xiàn)BS的DMEM稀釋的NDV和AIV接種細胞，吸附1 h后棄上清，換1% FBS維持液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于12和24 h后收取樣品，進行后續(xù)試驗。

1.4 Western blot

DF-1細胞復蘇盲傳數(shù)代后接種至6孔培養(yǎng)板中，感染病毒后指定時間收集細胞，使用SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液處理，樣品經(jīng)100 ℃水浴10 min，12 000 r·min-1離心后，-20 ℃保存。將處理后蛋白樣品進行10% SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)印至0.2 μm NC膜，脫脂乳封閉2 h，TBST清洗后，NDV-NP抗體4 ℃孵育過夜，TBST清洗殘留抗體后室溫鼠源二抗孵育2 h，TBST清洗殘余抗體后顯色；使用一抗二抗去除液處理NC膜，進行β-actin 抗體4 ℃孵育過夜，TBST清洗殘留抗體后室溫鼠源二抗孵育2 h，TBST清洗殘余抗體后顯色;AIV-NP抗體孵育步驟同NDV-NP抗體。

1.5 間接免疫熒光

DF-1細胞復蘇后盲傳數(shù)代接種至6孔板中(6孔 板中預先放入飛片)，感染病毒后12和24 h收取細胞，用4%多聚甲醛固定，PBS清洗后4 ℃ 短期保存；將固定好的細胞用Triton X-100室溫透化10 min，TBST清洗三遍后使用3% BSA、37 ℃ 封閉處理30 min， 接種1∶250 PBS稀釋的兔源AIV-NP抗體，37 ℃孵育1.5 h，TBST振蕩清洗3次，每次5 min，避光條件下使用山羊抗兔的熒光二抗進行染色，30 ℃孵育30 min，TBST處理后3% BSA封閉30 min；使用鼠源NDV-NP抗體孵育，二抗使用山羊抗鼠的熒光抗體，步驟同AIV-NP抗體孵育；DAPI細胞核染色，封片，激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察。

1.6 熒光定量PCR

DF-1細胞復蘇后盲傳3代接種至6孔板中，感染病毒后指定時間收集細胞，在細胞中加入1 mL TRIzol，按TRIzol Reagents操作手冊進行病毒RNA提取，運用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶依據(jù)通用引物：AGCAAAAGCAGG將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。分別使用編碼新城疫病毒NP蛋白和禽流感病毒NP蛋白基因序列設計特異引物，β-actin基因引物作為內(nèi)參(表1)。利用SYBR Premix ExTaqreagents進行相對定量熒光實時定量PCR，熒光定量PCR反應緩沖體系為20 μL： SYBR Premix ExTaq(2×) 10 μL，上游引物和下游引物各10 pmol，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，cDNA為模板20 ng，補ddH2O(滅菌蒸餾水)至20 μL。熒光定量PCR反應程序如下：95 ℃預變性30 s；(95 ℃ 5 s, 55 ℃ 30 s)×40個循環(huán)，最后加上熔解曲線反應以驗證擴增產(chǎn)物特異性。mRNA的相對表達量以-ΔΔCT方法計算[16]。

1.7 統(tǒng)計學分析

Western blot結果數(shù)據(jù)使用Image-Pro Plus進行蛋白灰度值分析：目的蛋白的灰度=目的蛋白IOD值/相對內(nèi)參IOD值；間接免疫熒光實驗數(shù)據(jù)使用Image-Pro Plus進行光密度值檢測病毒蛋白表達豐度分析；數(shù)據(jù)結果通過GraphPad Prism6進行作圖，Student’s test統(tǒng)計學分析(***代表P<0.001; **代表P<0.01,*代表P<0.05)。

表1AIVNP和NDVNP基因?qū)崟r熒光定量PCR引物序列

Table1TheprimersequencesofAIVNPandNDVNPforreal-timefluorescentquantitativePCR

引物Primer序列(5′→3′)SequenceNDV NP rtLAGCTGGGGTTGAAGATGATGNDV NP rtRACCGTGACCCATACTTGAGCAIV NP rtLGTCGCCAGTGGGTATGATTTAIV NP rtRCTAATGAGGCTGAAGACCTGACβ-actin rtLCAGACATCAGGGTGTGATGGβ-actin rtRTCAGGGGCTACTCTCAGCTC

2 結 果

2.1 NDV/AIV單獨感染后病毒蛋白表達

NDV Herts/33感染DF-1細胞后12 h出現(xiàn)細胞病變，24 h細胞開始脫落；AIV感染DF-1細胞后也是12 h出現(xiàn)細胞病變，24 h細胞開始脫落。由于AIV和NDV的NP蛋白在各型之間保守且與病毒基因組復制密切相關，因此本試驗運用Western blot通過檢測NDV和AIV NP蛋白的表達量變化來研究病毒復制情況，并通過Image-Pro Plus進行蛋白灰度值分析(目的蛋白的灰度=目的蛋白IOD值/相對內(nèi)參IOD值)。Western blot檢測顯示NDV和AIV均在感染后8 h左右進入對數(shù)復制期，NDV感染后16～24 h進入平臺期，AIV感染后8～24 h處于對數(shù)復制期(圖1)。該結果與病毒誘導細胞病變時間一致，12 h左右出現(xiàn)細胞病變，24 h左右細胞開始脫落，因此，筆者選取病毒感染后12和24 h作為共感染的樣品采集點。

A. NDV感染后不同時間點NP蛋白表達；B. NDV NP蛋白灰度掃描結果；C. AIV感染后不同時間點NP蛋白表達；D. AIV NP蛋白灰度掃描結果
A. The NP expression at different time points post NDV infection; B. The intensity band ratio of NDV NP to β-actin; C. The NP expression at different time points post AIV infection; D. The intensity band ratio of AIV NP to β-actin
圖1 NDV/AIV單獨感染不同時間點病毒蛋白Western blot檢測
Fig.1 Western blot analysis of virus protein at different time points post NDV/AIV infection individually

2.2 NDV-AIV共感染導致病毒蛋白水平降低

為了觀察NDV和AIV的共感染對兩種病毒復制的影響，通過Western blot對NDV和AIV的NP蛋白分別檢測并對檢測的病毒蛋白Western blot圖進行Image-Pro Plus蛋白灰度值分析。結果顯示兩種病毒共感染時AIV-NP和NDV-NP蛋白表達明顯受到了抑制(圖2A、2C)。與單獨感染NDV相比，Western blot灰度值共感染12和24 h NDV NP蛋白的表達分別下調(diào)了70.6% (P<0.001) 和45.7% (P<0.001)(圖2B)；而共感染12和24 h AIV NP蛋白的表達分別下調(diào)了61.5%(P<0.001) 和82.8%(P<0.001)(圖2D)。表明NDV和AIV的共感染能夠極顯著降低NDV和AIV病毒蛋白的表達。

A. NDV-AIV共感染對NDV NP蛋白表達的影響；B. NDV NP蛋白灰度掃描結果；C. NDV-AIV共感染對AIV NP蛋白表達的影響；D. AIV NP蛋白灰度掃描結果
A. The impact of NDV-AIV co-infection in NDV NP expression; B. The intensity band ratio of NDV NP to β-actin; C. The impact of NDV-AIV co-infection in AIV NP expression; D. The intensity band ratio of AIV NP to β-actin
圖2 NDV-AIV共感染對病毒蛋白表達的影響
Fig.2 The impact of NDV-AIV co-infection in virus protein expression

2.3 NDV-AIV共感染導致細胞中病毒蛋白豐度降低

為了更直觀地觀察共感染對細胞中病毒復制水平的影響，通過對單獨感染組和共感染試驗組中病毒蛋白進行熒光標記，激光共聚顯微鏡觀察細胞內(nèi)的病毒蛋白分布，結果顯示NDV/AIV單獨感染12 h 后，90%以上的細胞均顯示病毒蛋白熒光，而共感染組中僅能觀察到零星的紅色或綠色熒光點；病毒感染后24 h，單獨感染組中幾乎所有細胞均有病毒蛋白熒光，而共感染組中病毒蛋白熒光點有一定程度降低(圖3A)。為更直觀進行數(shù)據(jù)分析，對間接免疫熒光圖進行Image-Pro Plus光密度值分析：與單獨感染組相比，共感染組NDV和AIV的NP蛋白熒光密度值在感染12 h時間點分別下調(diào)81.1% (P<0.001) 和65.5%(P<0.001)(圖3B、C)，而24 h時則分別下調(diào)41.2%(P<0.05)和47.4%(P<0.001) (圖3B、C)。以上結果說明NDV-AIV共感染顯著降低了細胞中病毒蛋白豐度，與病毒感染晚期(24 h)相比，病毒感染后12 h細胞中病毒蛋白豐度降低的更明顯。

2.4 NDV-AIV共感染導致細胞中病毒mRNA水平降低

為了觀察NDV-AIV共感染是否在基因水平也能抑制病毒的復制，收取病毒感染后的細胞樣品，對NDV和AIV的NPmRNA進行實時熒光定量PCR檢測。與單獨感染NDV組相比，共感染12和24 h組NDVNP的mRNA水平分別下調(diào)了64.3% (P<0.001)和64.4% (P<0.05)(圖4A)；而與單獨感染AIV組相比，共感染12和24 h組AIV NP蛋白的表達分別下調(diào)了61.5%(P<0.001)和63.0%(P<0.001) (圖4B)。表明NDV-AIV共感染組中NDV和AIV的病毒基因mRNA水平均受到顯著抑制。

3 討 論

NDV和AIV屬于家禽養(yǎng)殖中最常見的兩種病毒，因此NDV和AIV臨床上發(fā)生共感染比較普遍。2008年美國明尼蘇達和北達科他州7 260份水禽泄殖腔拭子的PCR檢測結果顯示大部分樣品中都同時混有AIV和NDV，但將其接種雞胚，結果僅NDV被分離出來[17]，提示共感染過程中NDV對AIV的復制可能有抑制作用。2012年Ge等[18]的雞胚接種試驗表明AIV能夠抑制NDV復制，但NDV不能抑制AIV復制，除非NDV首先接種，一定時間后再接種AIV，NDV才能夠抑制AIV復制。體內(nèi)試驗結果顯示，弱毒NDV能夠延緩弱毒AIV病毒粒子的釋放，反之亦然[19]。這些試驗提示NDV與AIV之間存在互相干預，但都是基于流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)或基因水平的檢測[17-20]，尚未有蛋白或病毒水平的研究報道。

A. NDV-AIV共感染對NDV和AIV病毒蛋白豐度的影響；B. NDV NP光密度值計算結果；C. AIV NP光密度值計算結果
A. The impact of NDV-AIV co-infection in viral protein abundance in the cells; B. The optical intensity band ratio of NDV NP to DAPI; C. The optical intensity band ratio of AIV NP to DAPI
圖3 NDV-AIV共感染對細胞中病毒蛋白豐度的影響
Fig.3 The impact of NDV-AIV co-infection in viral protein abundance in the cell

A.NDV-AIV共感染對NDV NP mRNA水平的影響；B.NDV-AIV共感染對AIV NP mRNA水平的影響
A.The impact of NDV-AIV co-infection in NDV NP mRNA level; B. The impact of NDV-AIV co-infection in AIV NP mRNA level
圖4 NDV-AIV共感染對病毒mRNA水平的影響
Fig.4 The impact of NDV-AIV co-infection in viral mRNA level

NDV和AIV均有血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白，不能通過血凝試驗從混合感染樣本中分別檢測NDV和AIV；同時，這兩種病毒也有相似的細胞和雞胚嗜性，難以通過細胞或雞胚接種分別檢測病毒的復制水平。本研究通過NDV和AIV NP蛋白特異性抗體以及實時熒光定量PCR引物可以區(qū)分NDV和AIV感染，具有很好的特異性。與單獨感染組相比，共感染組NDV和AIV的NP蛋白熒光密度值在感染12 h時間點分別下調(diào)81.1%和65.5%，而24 h時則分別下調(diào)41.2%和47.4%；而共感染細胞中病毒NDVNP基因mRNA表達水平12和24 h分別下調(diào)了64.3%和64.4%，AIVNP基因mRNA表達分別下調(diào)了61.5%和63.0%。表明NDV-AIV共感染能夠顯著降低NDV和AIV NP蛋白與mRNA水平，在病毒感染對數(shù)生長期更明顯。這與以往的體內(nèi)試驗結果一致，由于細胞水平的試驗排除了諸如個體差異、組織親嗜性等一些復雜因素的影響，因此，本研究為NDV與AIV之間相互抑制提供了更有力的證據(jù)。

AIV與NDV在體外與體內(nèi)相互之間的干擾現(xiàn)象雖已被證實，但其機制尚未闡明。值得注意的是，本研究的間接免疫熒光中DF-1細胞中同時有NDV NP和AIV NP的熒光染色，證明兩種病毒能夠在同一個細胞中復制，這說明兩種病毒能同時感染同一個細胞，這并不能作為兩者之間相互干擾的解釋。本研究基于雞成纖維細胞模型，因此可以排除一些由特殊的免疫器官和免疫細胞介導的獲得性免疫機制，先天性的抗病毒機制可能在其中發(fā)揮重要作用。一種最有可能的解釋是，NDV或AIV感染產(chǎn)生的干擾素(IFN)和下游抗病毒分子能夠抑制另一種病毒的復制，IFN-α/β能與Ⅰ型干擾素受體結合，通過活化JAK-STAT信號通路誘導達300多種干擾素刺激的基因的表達，其中包括抗病毒蛋白。目前已經(jīng)得到證實的可以抑制病毒增殖的干擾素刺激基因有PKR、MXGTPase和RNaseL等[21]。這些抗病毒分子可能在共感染過程中發(fā)揮協(xié)同抑制的作用。除了IFN之外，另一種可能是NDV和AIV的共感染過程中協(xié)同引起細胞凋亡信號通路的激活[22]，從而抑制了兩種病毒的復制。此外，細胞自噬[23]等其他先天性的抗病毒信號通路也可能參與其中。本研究證實了細胞水平上AIV與NDV的復制存在相互抑制現(xiàn)象，這為研究NDV和AIV的共感染機制奠定了基礎，從另一角度為臨床上兩種病毒的防控提供了新的線索。

4 結 論

運用實時熒光定量PCR、Western blot和間接免疫熒光檢測了H9N2亞型AIV和NDV單獨感染與共感染DF-1細胞對兩種病毒NP蛋白表達的相互影響。與單獨感染組相比，NDV和AIV的共感染極顯著降低了感染細胞中兩種病毒核蛋白的表達水平和細胞中核蛋白的豐度；共感染組細胞中的病毒核蛋白基因mRNA表達水平也極顯著降低。表明AIV與NDV的共感染在細胞水平上可引起病毒復制的相互抑制，為研究NDV和AIV的共感染機制在細胞水平上奠定了基礎。