呂 艷，翟國蓮，常江艷，石蓮琴，元正菊，趙煥云，鄒豐才，段博芳*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，昆明 650201; 2.云南省動物疫病預(yù)防控制中心，昆明 650201； 3.永德縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，永德 677600； 4.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224)

貓血巴爾通氏體(Haemobartonellafelis,H.felis)是引起貓傳染性貧血的一種血液原蟲，主要寄生于貓紅細胞表面，該病主要感染貓，呈急性和亞急性慢性發(fā)病等?；疾游锿ǔ３尸F(xiàn)貧血、黃疸、血紅蛋白尿等癥狀，但慢性感染時臨床癥狀不明顯[1],主要通過輸血、吸血昆蟲叮咬或經(jīng)過卵將病原傳播給下一代[2]。1953年Flint和Moss[3]首次報道貓血巴爾通氏體之后，2010年在我國廣州地區(qū)有貓血巴爾通氏體感染的相關(guān)報道[4]。

到目前為止，基于貓血巴爾通氏體16S rRNA基因序列的種系發(fā)育鑒定，貓血巴爾通氏體有3個病原株：貓大型血巴爾通氏體(Mycoplasmahaemofelis，Mhf，又叫Haemobartonellafelis，H.felis)、貓小型血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasma haemominutum，CMhm)及CandidatusMycoplasma turicensis(CMt)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，貓小型血巴爾通氏體在貓中感染率較高且較為普遍，而貓大型血巴爾通氏體感染率較低且致病性強，CandidatusMycoplasma turicensis感染率及致病性相對較弱[7-8]。針對云南地區(qū)貓感染貓血巴爾通氏體的情況尚缺乏報道。

本研究采用PCR擴增貓血巴爾通氏體16S rRNA基因序列，通過序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建，獲悉云南地區(qū)貓血巴爾通氏體的流行情況，為云南貓中貓血巴爾通氏體病的防治提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)信息。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2016年1月至2017年10月從云南昆明市某寵物醫(yī)院、玉溪市某寵物醫(yī)院、版納州勐臘縣、紅河州金平縣、臨滄市滄源縣5個地區(qū)采集無菌抗凝貓血液樣品338份，樣品信息見表1。

表1樣品信息表

Table1Thesampleinformation

只

1.2 DNA提取

DNA提取參照TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒操作進行(試劑批號：Q5612)，DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 貓血巴爾通氏體種類的初步鑒定

采用Jensen等[9]的方法進行PCR擴增，該方法能鑒別區(qū)分貓體內(nèi)感染貓大型血巴爾通氏體(H.helis/Large-form，Mycoplasmahaemofelis)和貓小型血巴爾通氏體(H.felis/Small-form，CandidatusMycoplasma haemominutum)的感染，預(yù)計擴增片段大小分別為170和193 bp。引物序列如下，352-F:5′-ACGAAAGTCTGATGGAGCAATA-3′，544-R：5′-ACGCCCAATAAATCCG(A/G)ATAATPCR-3′，擴增體系：總體積25 μL，其中Premix-Taq12.5 μL,引物濃度為50 μmol·L-1，DNA標(biāo)準(zhǔn)模板2 μL，加水至25 μL，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)；最后72 ℃再延伸5 min。其中陽性對照樣品來自于本實驗室保存樣，陰性對照為無菌水。

1.4 16S rRNA基因的擴增

檢測得到的1份貓大型血巴爾通氏體感染根據(jù)2014年Aquino等[10]報道的PCR方法擴增，完成貓血巴爾通氏體病原體16S rRNA大于1 000 bp的測序檢測，PCR擴增體系：總體積50 μL，其中Premix-Taq25 μL,引物濃度為50 μmol·L-1,貓血巴爾通氏體DNA標(biāo)準(zhǔn)模板5 μL,加水至50 μL，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；變性95 ℃ 10 s；退火62 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s進行45個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

1.5 電泳與序列分析

取擴增后的PCR產(chǎn)物7 μL，選用DL2000 marker、2%瓊脂糖凝膠進行電泳，30 min后在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果、拍照。將出現(xiàn)預(yù)期條帶的擴增產(chǎn)物送至生工生物工程有限公司進行雙向測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)核酸比對系統(tǒng)比對。

1.6 生物信息學(xué)分析

采用DNAMAN、MEGA6等分子生物學(xué)軟件進行序列拼接與校正，將測得序列與GenBank中公布的貓血巴爾通氏體的16S rRNA標(biāo)準(zhǔn)序列進行比對，采用鄰位相連法(neighbor-joining)繪制遺傳進化樹，分析檢獲樣本的種屬關(guān)系。同時，使用SPSS22.0完成感染因素分析。

2 結(jié) 果

2.1 感染情況

338份樣品中，檢出貓血巴爾通氏體陽性21個，其感染率為6.21%。其中陽性樣品均來自于寵物貓，陽性率為7.98%，電泳圖見圖1。

2.2 16S rRNA核苷酸序列及系統(tǒng)進化樹分析

本試驗得到貓大型血巴爾通氏體16S rRNA核苷酸序列，見表2(GenBank登陸號：MH447082)。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～21. 檢測樣品；+. 陽性對照；-. 陰性對照
M. DL2000 marker; 1-21. Test sample; +. Positive control; -. Negative control
圖1 貓血巴爾通氏體16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳圖
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of Haemobartonella felis 16S rRNA PCR products

表216SrRNA核苷酸序列信息表

Table216SrRNAnucleotidesequenceinformationtable

位置Position16S rRNA核苷酸序列(5′→3′)16S rRNA nucleotide sequence位置Position1GGGGGCTGGGGCACGGGTGAGTATACATATCTAACATGCCCCTCTGTGGG-GGATAGCCGCTTGAAAAAGCGATTAATACCCCATAGGAAG9091CTTTATCCATGATTTAGCTTTTAAAGCCTTCGGGCGCTGAGGGATTG-GGATATGCTCTATTAGCTAGTTGGCGGGATAAAAGCCCACCAA180181GGCAATGATAGATAGCTGGTCTTAGAGGATGAACAGCCACAATGG-GATTGAGATACGGCCCATATTCCTACGGGAAGCAGCAGTAGGGAA270271TCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATACCATGTGAACG-ATGAAGGCCTTTTTGGTTGTAAAGTTCTTTTACGAGGGATAATT360361ATGATAGTACTTCGTGAATAAGTGACAGCAAACTATGTGCCAGCAG-CTGCGGTAATACATAGGTCGCGAGCATTATTCGGATTTATTGGG450

(續(xù)表2 Continued)

基于貓血巴爾通氏體的16S rRNA種系發(fā)育分析，對1例為貓大型血巴爾通氏體(Mycoplasmahaemofelis)樣本序列構(gòu)建進化樹，根據(jù)鄰接法(NJ)建立系統(tǒng)發(fā)育樹，利用MEGA6.0構(gòu)建種系發(fā)育進化樹，進化樹見圖2。

“▲”表示本研究鑒定的貓大型血巴爾通氏體
Haemobartonella felis isolates identified in this study are indicated by ▲
圖2 貓血巴爾通氏體基于16S rRNA基因序列種系發(fā)育樹
Fig.2 Phylogenetic analysis of Haemobartonella felis isolated from cats based on 16S rRNA gene sequences

2.3 不同養(yǎng)殖模式和不同年齡階段貓的感染率

被檢動物中，市區(qū)內(nèi)寵物貓的感染率為7.98%，農(nóng)村散養(yǎng)貓中未檢出陽性，見表3，不同養(yǎng)殖模式之間差異顯著(P<0.05)；根據(jù)年齡將檢測的樣品劃分為三個階段，各年齡階段均有感染分布，其中小于5月齡，感染率為2.25%(2/89)，6～9月齡，感染率為4.17%(4/96)，10月齡以上，感染率為9.80%(15/153)，各年齡之間差異顯著(P<0.05)，見表4。

表3養(yǎng)殖模式與貓血巴爾通氏體感染率的關(guān)系

Table3PrevalenceofHaemobartonellafelisindifferentnurturemodelsofcats

養(yǎng)殖模式Nurture models數(shù)量/只Samples numberPCR檢測 PCR amplification陽性數(shù)/只Positive感染率/%Infection rateP值 (95%CI)P-value (95%CI)市區(qū)飼養(yǎng)Pet cats of urban263217.98Reference農(nóng)村散養(yǎng)Rural of free-range75000.014 (0.016～0.143)總計 Total338216.210.003(0.198～0.921)

表4年齡與貓血巴爾通氏體感染率的關(guān)系

Table4PrevalenceofHaemobartonellafelisindifferentagesofcats

年齡(月齡)Age (Month)數(shù)量/只Samples number陽性數(shù)/只Positive感染率/%Infection rateP值 (95%CI)P-value (95%CI)≤58922.25Reference6～99644.170.077 (0.132～0.007)≥10153159.800.002 (0.161～0.035)

3 討 論

3.1 貓血巴爾通氏體的感染情況分析

已有文獻報道貓血巴爾通氏體的感染率與貓的年齡有一定的相關(guān)性[11]，本次檢測發(fā)現(xiàn)各個年齡階段的貓均有感染，總體感染率為6.21%，其中10月齡以上的貓感染率為9.80%，相對于其他年齡階段的貓感染率較高。其中感染類型以貓小型血巴爾通氏體為主，這與2004年Tasker等[12]和2005年Willi等[6]報道的結(jié)果一致，說明在云南的貓群中貓血巴爾通氏體的感染沒有明顯的時間及地域差異性。本次試驗從貓養(yǎng)殖模式分析中還發(fā)現(xiàn)，市區(qū)內(nèi)飼養(yǎng)的寵物貓感染率明顯高于農(nóng)村散養(yǎng)貓，這與2010年莊慶均等[4]對廣州地區(qū)貓血巴爾通氏體流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果不一致，可能原因，本次試驗收集農(nóng)村家養(yǎng)貓的樣本代表性不強，另一方面也說明隨著寵物貓與人類的關(guān)系越來越親近，提示在貓的圈養(yǎng)中要加強其免疫預(yù)防措施。

3.2 貓大型血巴爾通氏體的分子遺傳分析

貓大型血巴爾通氏體是引起貓傳染性貧血的一類血液寄生蟲，擴增得到貓大型血巴爾通氏體近全長的16S rRNA基因序列，該序列與Mycoplasmahaemofelis(GenBank登錄號：EU839978)相似性高達98.6%，與感染鼠血巴爾通氏體相似性為86.3%， 測序分析結(jié)果與1998年Foley等[13]的分析結(jié)果一致，本試驗從分子水平上證實了云南地區(qū)存在貓大型血巴爾通氏體的感染。

3.3 不同養(yǎng)殖模式和年齡的感染因素分析

本研究采用PCR對來自云南部分地區(qū)不同養(yǎng)殖模式的貓血液樣品進行了16S rRNA的基因擴增，檢出市區(qū)內(nèi)飼養(yǎng)貓感染率為7.98%(21/263)，養(yǎng)殖模式之間感染率有差異，且差異顯著(P<0.05)，說明養(yǎng) 殖模式與其感染率關(guān)系密切。小于5月齡貓血89份，6～9月齡貓血96份，10月齡以上貓血153份。各年齡階段均有分布，其中小于5月齡感染率2.25%(2/89)，6～9月齡感染率4.17%(4/96)，10月齡感染率9.80%(15/153)，檢測三個年齡段之間的感染率差異性顯著(P<0.05)。結(jié)果顯示貓血巴爾通氏體的感染率與貓年齡大小有著密切關(guān)系，年齡越大的貓越容易感染，可能原因隨著貓年齡增大其免疫力低下，感染貓血巴爾通氏體的概率增大。

4 結(jié) 論

4.1云南部分地區(qū)貓血巴爾通氏體的感染以貓小型血巴爾通氏體為主。

4.2本試驗對貓血巴爾通氏體16S rRNA測序分析，得到一個貓大型血巴爾通氏體的16S rRNA核苷酸序列，應(yīng)高度關(guān)注這種病原體引起的貓的嚴(yán)重貧血癥。

4.3貓對于感染貓血巴爾通氏體與其養(yǎng)殖模式和年齡密切相關(guān)。

綜上所述，通過對云南部分地區(qū)貓的血液樣品進行檢測，本試驗首次報道了云南省部分地區(qū)貓血巴爾通氏體的感染情況，揭示了貓血巴爾通氏體在云南的流行，亦為該病的防控提供了支撐數(shù)據(jù)。