張廷煥，柴 捷，陳 磊，龍 熙*

(1. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460； 2.農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460)

家畜在長(zhǎng)期的馴化過(guò)程中受到了不同選擇,毛色呈現(xiàn)出不同的變化[1]。毛色在動(dòng)物生理調(diào)節(jié)和環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中起著重要作用，比如不同毛色會(huì)導(dǎo)致熱交換出現(xiàn)差異，從而影響動(dòng)物體溫的調(diào)控[2]。除此之外，在家畜育種中，毛色更是作為一種經(jīng)濟(jì)性狀受到強(qiáng)烈的人工選擇。家豬毛色變異復(fù)雜，如果能明確毛色變異分子機(jī)制，可以通過(guò)遺傳育種手段定向改變家豬毛色，形成特定品種特征，提高群體的表型一致性。

毛色是由表皮、毛囊內(nèi)黑色素細(xì)胞的分布和活性決定的[3-4]。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-M型(microphthalmia associated transcription factor M,MITF-M)選擇性表達(dá)于黑色素細(xì)胞中，控制著黑色素細(xì)胞的發(fā)育、功能和凋亡，在黑色素生成通路中居于核心位置[5-6]。MITF-M還調(diào)控著3大主要色素合成酶包括酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸相關(guān)蛋白1(TYRP1)和酪氨酸相關(guān)蛋白2(TYRP2)[7]的轉(zhuǎn)錄。目前在多個(gè)物種(比如，雞、牛、羊)上已證明,MITF-M對(duì)動(dòng)物毛色變化起著至關(guān)重要的作用[8-10]，而豬毛色全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，MITF基因位點(diǎn)在不同程度毛色白化的豬種中受到強(qiáng)烈選擇，比如，巴馬香豬、寧鄉(xiāng)豬、五指山豬等。同時(shí)，在榮昌豬中的研究證實(shí)，MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)一個(gè)位點(diǎn)的插入突變引起了SOX蛋白的結(jié)合，影響了MITF-M的轉(zhuǎn)錄活性降低其表達(dá)水平，最終導(dǎo)致豬毛色白化現(xiàn)象[11]。然而，豬MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的結(jié)構(gòu)和功能尚不清楚，關(guān)于豬MITF-M主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域及其轉(zhuǎn)錄因子的研究尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)以豬DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到MITF-M的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域；采用生物信息學(xué)對(duì)調(diào)控區(qū)的序列特征進(jìn)行分析；根據(jù)序列結(jié)構(gòu)特征分布情況構(gòu)建5′端缺失報(bào)告基因重組載體；利用雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)對(duì)重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活性分析，尋找活性差異的調(diào)控區(qū)域；再利用干擾RNA技術(shù)手段對(duì)差異區(qū)域內(nèi)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。本試驗(yàn)結(jié)果可為豬MITF基因的表達(dá)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，也為深入研究豬毛色變化的調(diào)控機(jī)理提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 采集3只榮昌豬新生小母豬耳組織樣，提取基因組DNA，用于擴(kuò)增MITF-M基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。榮昌豬來(lái)自重慶市畜牧科學(xué)院安富豬場(chǎng)。

1.1.2 細(xì)胞 B16細(xì)胞(小鼠黑色素瘤細(xì)胞系)、貼壁細(xì)胞購(gòu)于上海酶研生物科技公司。

1.1.3 試劑 DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、Q5超保真DNA聚合酶和內(nèi)切酶均購(gòu)自NEB公司；蛋白酶K、GoTaq?qPCR Master Mix和雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)試劑盒購(gòu)自Promega公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；干擾RNA購(gòu)自Ribobio公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；瓊脂糖、DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1MITF-M基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)克隆以及5′端缺失重組載體構(gòu)建 本試驗(yàn)以榮昌豬DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增得到6 414 bp的MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。50 μL反應(yīng)體系：5×Q5 reaction buffer 10 μL，dNTP mixture(2.5 mmol·L-1)1 μL, Q5高保真酶(10 U·μL-1)0.5 μL,正、反向引物(10 μmol·L-1) 各1.5 μL，ddH2O 35.5 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。為了進(jìn)一步產(chǎn)生后續(xù)的克隆片段，將XhoI和NheI兩個(gè)酶切位點(diǎn)加到引物的5′端。再以6 414 bp片段為模板，成功擴(kuò)增另外8個(gè)5′端缺失片段，大小分別為1 140、1 397、 2 470、 3 753、5 201、5 429、 6 036 和 6 274 bp。隨后將所有片段經(jīng)過(guò)XhoI和NheI酶切后，利用T4連接酶亞克隆到pGL3-basic骨架載體上，構(gòu)建了9個(gè)調(diào)控區(qū)5′端缺失重組載體：pGL3-1140、pGL3-1397、pGL3-2470、pGL3-3753、pGL3-5201、pGL3-5429、pGL3-6036、pGL3-6274、pGL3-6414，再通過(guò)測(cè)序和酶切電泳鑒定(圖1)，確認(rèn)載體構(gòu)建成功。所用引物信息見表1。

1.2.2MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)生物信息學(xué)分析 從ENSEMBL(http://www.ensembl.org)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到了其他4個(gè)物種(人、鼠、牛、狗)的MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列；在線軟件Neural Network Promoter Prediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)用于預(yù)測(cè)MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)核心啟動(dòng)子；MEME在線軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)發(fā)掘5個(gè)物種間MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)保守的序列(Motif)；在線軟件JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)用于預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

圖1 豬MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域重組載體酶切電泳圖
Fig.1 Enzyme digestion electrophoresis of pig MITF-M transcriptional regulatory regions

表1MITF-M重組載體構(gòu)建引物

Table1PrimersforthevectorsconstructionofMITF-M

引物名稱Name引物序列(5′→3′)Sequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpLength重組載體Recombinant plasmidTSSR+Xho ⅠCCGCTCGAGCGGccggaaactttatcacagcagctc-1140F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGtgtctggaccctttatgaaactcaca1 140pGL3-1140-1397F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGaagcttactctgataaccccaactta1 397pGL3-1397-2470F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGatggccactttatattaaggactttg2 470pGL3-2470-3753F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGcaaacagtggatggactaggaggact3 753pGL3-3753-5201F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGgcattttcattcttttaacggctgag5 201pGL3-5201-5429F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGagtcccaaactcctaatttatccttc5 429pGL3-5429-6036F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGgcttctacatgataggaaaattggat6 036pGL3-6036-6274F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGcatacacacttctatgaattcctcct6 274pGL3-6274-6414F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGctttccagagttgctggaagttttgt6 414pGL3-6414

引物序列中的大寫字母為限制性酶切位點(diǎn)；TSS代表轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

Uppercase letters in the primer sequences are restriction sites andTSSrepresent transcription start site

1.2.3MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)活性分析 采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域9個(gè)重組載體(每孔1 000 ng)和陰性對(duì)照pGL3-basic(每孔1 000 ng)分別與內(nèi)參載體pRL-TK(每孔700 ng)共轉(zhuǎn)染到B16細(xì)胞內(nèi)，48 h后裂解細(xì)胞，采用Promega公司的雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒及Thermo公司的熒光和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(Thermo Scientific FLuoroskan Ascent FL)來(lái)測(cè)量分析。用每個(gè)孔的海腎熒光素酶發(fā)光值(pRL-TK)為內(nèi)參校正螢火蟲熒光素酶發(fā)光值(重組載體)，得到每個(gè)重組載體的轉(zhuǎn)錄活性值，再除以陰性對(duì)照pGL3-basic的活性值獲得每個(gè)重組載體的相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性值。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄因子KLF4和Meis1干擾RNA試驗(yàn) 由于在本試驗(yàn)研究過(guò)程中篩選出可能影響MITF-M轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)調(diào)控因子，故設(shè)計(jì)了KLF4和Meis1基因干擾RNA的試驗(yàn)(表2)，分別將其與重組載體和內(nèi)參載體pRL-TK共轉(zhuǎn)染到B16細(xì)胞內(nèi)，48 h后收集細(xì)胞分成兩份，一份用于上述的雙熒光素酶活性檢測(cè)，獲得重組載體的轉(zhuǎn)錄活性值；另一份用于提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)干擾RNA的基因干擾效率，10 μL反應(yīng)體系：GoTaq?qPCR Master Mix(2×)5 μL，正、反向引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL，CXR 0.1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，其中KLF4正向引物：5′-GCCGCTCTCGCTTATCTTCG-3′，反向引物：5′-GTCTTGCTACCCTGCTCCTT-3′；Meis1正向引物：5′-AAGCAGTTGGCACAAGATACAGGA C-3′，反向引物：5′-TGACTGCTCGGTTGGACTGG-3′。采用2-△△Ct方法計(jì)算KLF4和Meis1基因表達(dá)量。

表2KLF4和Meis1基因的干擾RNA序列

Table2TheinterferingRNAsequencesofKLF4andMeis1genes

名稱Name序列(5′→3′) Sequence正義鏈 Sense反義鏈 AntisensesiKLF4-1CACCCACACUUGUGACUAUTTAUAGUCACAAGUGUGGGUGTTsiKLF4-2GGUCAUCAGUGUUAGCAAATTUUUGCUAACACUGAUGACCTTsiMeis1-1GCUUUAAAGAGAGAUAAAGTTCUUUAUCUCUCUUUAAAGCTTsiMeis1-2AUGAAGAUAUAGCGGUGUUTTAACACCGCUAUAUCUUCAUTT

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 使用Excel2013進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，用SPSS19軟件中的Student′st-test或ANOVA進(jìn)行差異顯著分析，使用Publisher2013作圖。

2 結(jié) 果

2.1 物種間MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)生物信息學(xué)分析

本試驗(yàn)以榮昌豬DNA為模板，采用巢式PCR成功擴(kuò)增出MITF-M轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)前6 414 bp調(diào)控區(qū)域。把6 414 bp的DNA序列輸入在線軟件Neural Network Promoter Prediction，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)4個(gè)核心啟動(dòng)子，都位于TSS～-1 427 bp內(nèi)(表3)。

隨后構(gòu)建了豬與其他4個(gè)物種(人、小鼠、牛、狗)MITF-M6 414 bp調(diào)控區(qū)序列的進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)豬和牛的親緣關(guān)系較近，與小鼠最遠(yuǎn)(圖2b)。同時(shí)，利用MEME軟件分析5個(gè)物種間保守的序列模塊(Motif)，每一個(gè)Motif都可能存在與轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域功能相關(guān)的調(diào)控序列。MEME分析結(jié)果表明(圖2a)，5個(gè)物種MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域序列存在規(guī)律性簇狀排列的Motifs，比如，TSS～-1 100 bp區(qū)域內(nèi)包括Motif 1、3、4、7、8、11、13，除了小鼠缺失Motif 8外，其他Motifs在物種間分布保守；在-1 200 ～-1 400 bp區(qū)域內(nèi)也包括3個(gè)分布保守的Motif 2、5、10；而從-1 400 bp到-4 830 bp，Motif 6、9、12、14、15在物種間的分布出現(xiàn)較大的差異，同時(shí)小鼠缺失Motif 6、12、15。

通過(guò)上述生物信息學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)，TSS～-1 400 bp區(qū)域存在大多數(shù)核心啟動(dòng)子和保守的Motifs，暗示這個(gè)區(qū)域?qū)ITF-M的轉(zhuǎn)錄調(diào)控至關(guān)重要。

表3豬MITF-M調(diào)控區(qū)域內(nèi)核心啟動(dòng)子分布

Table3ThedistributionofcorepromotersinMITF-Mregulatoryregion

起始位點(diǎn)/bpStart結(jié)束位點(diǎn)/bpEnd啟動(dòng)子序列(5′→3′)Promoter sequence 分?jǐn)?shù)Score (0～1)-1 427-1 377CTCAATTATTTAAAAAGGCACTGACAATAAAAGCTTACTCTGATAACCCC0.98-1 262-1 212AACATTTATTTTTAAATGTGCAGCCCTTTCTTTTTTAAGTGACATAGTGA0.86-1 001-951ATTCTTGTGCTTAAAATACCTCACCATTTCAGCAGTGAAAATCGGCCATT0.84-535-485AGGATGTTTGTACATATATCCAGCTGAGAATAAGATGCACATTGAGACCA0.88

a.MEME數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的保守Motif的分布情況，Motif 1至Motif 15表示調(diào)控區(qū)域存在的序列模塊(Motif)，保守的Motif用相同顏色表示，平均長(zhǎng)度為50 bp，不同的顏色代表不同的Motif(TSS代表轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))；b. MEGA7構(gòu)建的物種間系統(tǒng)發(fā)育樹
a.The distribution of conserved Motifs were predicted by MEME database, Motif 1 to 15 showed sequence modules existing in regulatory regions and conservative Motif had the same color, different Motifs were represented by different colored boxes, the average length of the Motif was 50 bp(TSS represented transcription start site); b. The Neighbor-joining phylogenetic tree was constructed using MEGA7 with 6 414 bp sequences of MITF-M
圖2 5個(gè)物種MITF-M 6 414 bp轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹以及Motif分布情況
Fig.2 Phylogenetic tree and Motif composition of 6 414 bp promoter region of MITF-M in 5 species

2.2 豬MITF-M基因轉(zhuǎn)錄活性分析

為了確定豬MITF-M基因的重要轉(zhuǎn)錄區(qū)域，本試驗(yàn)根據(jù)上述核心啟動(dòng)子和Motif的分布情況，成功構(gòu)建出9個(gè)5′端缺失重組載體，分別為pGL3-1140、pGL3-1397、pGL3-2470、pGL3-3753、pGL3-5201、pGL3-5429、pGL3-6036、pGL3-6274、pGL3-6414(圖1)。

通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)和雙熒光素報(bào)告基因試驗(yàn)，得到了每個(gè)重組載體的相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性值。如圖3所示，所有9個(gè)重組載體的轉(zhuǎn)錄活性都高于空載體pGL3-basic,但隨著插入片段5′端延長(zhǎng)，MITF-M調(diào)控區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生了變化。相比pGL3-1140，pGL3-1397的活性有顯著的上升，說(shuō)明片段-1 140～-1 397 bp內(nèi)含有正向調(diào)控元件；pGL3-1397和pGL3-2470的活性沒有顯著差異，都具有很高的轉(zhuǎn)錄活性；而pGL3-2470和pGL3-3753之間的活性出現(xiàn)了顯著的下降，甚至高達(dá)5～6倍的活性變化，說(shuō)明-2 470～-3 753 bp這個(gè)區(qū)域可能存在極強(qiáng)的負(fù)向調(diào)控元件；pGL3-3753、pGL3-5201、pGL3-5429之間的活性沒有顯著差異，而且維持較低的轉(zhuǎn)錄活性；但與pGL3-5429相比，pGL3-6036活性呈現(xiàn)顯著的上升，說(shuō)明片段-5 429～-6 036 bp內(nèi)含有正向調(diào)控元件；而pGL3-6036、pGL3-6274、pGL3-6414之間活性沒有顯著差異。

由此，鑒定出豬MITF-M基因3個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄活性顯著變化的區(qū)域，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子KLF4調(diào)控豬MITF-M基因轉(zhuǎn)錄活性

為了進(jìn)一步確定上述顯著變化區(qū)域內(nèi)的重要調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子，本試驗(yàn)運(yùn)用JASPAR軟件預(yù)測(cè)這3個(gè)區(qū)域中潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(表4)。轉(zhuǎn)錄因子KLF4預(yù)測(cè)得分最高，而且已有研究報(bào)道KLF4與黑色素的合成直接相關(guān)[11]；再結(jié)合前面MEME分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)只有轉(zhuǎn)錄因子Meis1的結(jié)合位點(diǎn)位于Motif(Motif 12)上；而且KLF4和Meis1均未報(bào)道參與MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

為了證實(shí)它們與MITF-M的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系，本試驗(yàn)合成了KLF4和Meis1基因的干擾RNA各2條(siKLF4和siMeis1)(表2)，將其轉(zhuǎn)入B16細(xì)胞48 h 后，利用RT-PCR發(fā)現(xiàn)基因干擾效率均在90%以上(圖4)，其中siKLF4-1和siMeis1-2的干擾效率更高，可用于后續(xù)干擾試驗(yàn)。隨后，MITF-M重組載體和干擾RNA(siKLF4-1或siMeis1-2)共轉(zhuǎn)染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(無(wú)義干擾RNA)相比，干擾KLF4基因表達(dá)時(shí)，pGL3-2470 與pGL3-3753活性的比值有顯著的下降，由原來(lái)約5倍的比值下降到約3倍，說(shuō)明KLF4確實(shí)負(fù)向調(diào)控這個(gè)區(qū)域的活性變化。然而，干擾Meis1后，pGL3-2470 與pGL3-3753活性的比值卻沒有發(fā)生顯著變化，說(shuō)明Meis1對(duì)這個(gè)區(qū)域的活性沒有調(diào)控作用(圖5)。

A. 豬MITF-M調(diào)控區(qū)Motif分布圖以及5′截短片段示意圖；B.9個(gè)5′截短片段重組載體以及空載體pGL3-basic的轉(zhuǎn)錄活性，***表示P<0.001
A. The diagram of Motif distribution and 5′ truncated fragments in the regulaory region of pig MITF-M gene; B.The transcriptional activity of recombinant vectors containing 9 5′truncated fragments and pGL3-basic, *** indicate P<0.001
圖3 豬MITF-M調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄活性分析
Fig.3 The transcriptional activities of the pig MITF-M regulatory regions

由此，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KLF4可以通過(guò)兩種不同的結(jié)合序列對(duì)MITF-M轉(zhuǎn)錄活性起負(fù)向調(diào)控作用。

表4MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)

Table4TheputativebindingsitesoftranscriptionfactorsinthetranscriptionalregulatoryregionsofMITF-M

區(qū)域/bpRegion轉(zhuǎn)錄因子Transcription factor預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)MCS起始/bpStart結(jié)束/bpEnd預(yù)測(cè)位點(diǎn)序列Predicted site sequence-2 470～-3 753KLF415.416-2 836-2 827TGGGTGTGGCBhlha1513.595-2 846-2 839CCATATGTSox510.898-2 768-2 762ATTGTTASox510.898-2 739-2 733ATTGTTTMeis110.323-3 526-3 520TTGACAGNFIC9.697-3 177-3 172TTGGCAMZF19.085-2 664-2 659TGGGGASOX108.910-2 816-2 829CTTTGTMAFG::NFE2L18.812-2 840-2 835CATGAC

(續(xù)表4 Continued)

圖4 KLF4和Meis1干擾RNA在B16細(xì)胞中干擾基因表達(dá)的效率
Fig.4 The interference efficiency of siKLF4 and siMeis1 in B16 cells

**表示差異顯著(P<0.01)，下同
** indicate the significant difference(P<0.01),the same as below
圖5 KLF4 和Meis1干擾RNA對(duì)MITF-M轉(zhuǎn)錄活性的影響
Fig.5 Effect of siKLF4 and siMeis1 on the transcription activity of MITF-M

NS表示差異不顯著(P>0.05)
NS indicate the difference is not significant(P>0.05)
圖6 KLF4負(fù)向調(diào)控MITF-M轉(zhuǎn)錄
Fig.6 Negative effect of KLF4 on the transcription activity of MITF-M

3 討 論

毛色是豬的一個(gè)重要形態(tài)學(xué)特征，由表皮、毛囊內(nèi)黑色素細(xì)胞的分布和活性決定。而MITF-M基因控制著黑色素細(xì)胞的色素合成和沉積，被視作毛色主要調(diào)控因子。MITF-M調(diào)控著大量與色素合成和黑色素細(xì)胞分化相關(guān)的基因，同時(shí)還控制著黑色素瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。Chen等[11]發(fā)現(xiàn)，敲除MITF-M的轉(zhuǎn)基因小鼠，毛色出現(xiàn)全白的現(xiàn)象，與此同時(shí)毛色相關(guān)基因的表達(dá)水平也發(fā)生顯著變化。同時(shí)已有大量研究表明，MITF-M的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)與動(dòng)物毛色的改變有著密切的聯(lián)系，在狗毛色的研究中發(fā)現(xiàn)，MITF-M的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)4個(gè)位點(diǎn)的突變與狗的毛色變化高度相關(guān)[12-13]；馬MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)近端的出現(xiàn)一個(gè)位點(diǎn)的插入突變導(dǎo)致了馬毛色變化[14-16]；不同毛色的豬全基因組關(guān)聯(lián)分析證明，MITF所在區(qū)域與毛色高度相關(guān)[17-18]，而且豬MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)遠(yuǎn)端出現(xiàn)一個(gè)沉默子，導(dǎo)致MITF-M的表達(dá)缺失，從而引起毛色白化現(xiàn)象。這一切都證明MITF-M的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)對(duì)動(dòng)物毛色的重要性。本試驗(yàn)獲得了豬MITF-M6 414 bp的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MITF-M的啟動(dòng)子都位于TSS～-1 427 bp內(nèi)，符合大多數(shù)基因啟動(dòng)子的分布，而這個(gè)區(qū)域包含了絕大多數(shù)Motifs的分布，后續(xù)的雙熒光素報(bào)告基因試驗(yàn)也證明了pGL3-1397的轉(zhuǎn)錄活性是最高的，說(shuō)明這段區(qū)域?qū)τ趩?dòng)MITF-M的轉(zhuǎn)錄極為重要，這與Chen等[18]對(duì)MITF-M的研究結(jié)果相符。本研究中，在MITF-M基因的-1 140～-1 397 bp之間轉(zhuǎn)錄活性有顯著的變化，但當(dāng)干擾到結(jié)合在Motif 2上的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)后，pGL3-1397的活性顯著上升，說(shuō)明物種間保守的Motif 2可能對(duì)MITF-M轉(zhuǎn)錄起著重要作用。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在pGL3-2470和pGL3-3753之間存在著一個(gè)高達(dá)5～6倍的轉(zhuǎn)錄活性變化，后續(xù)試驗(yàn)證實(shí)，干擾KLF4表達(dá)后，活性比值只減小到3倍，說(shuō)明 片段-2 470～-3 753 bp之間還存在其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，有待進(jìn)一步挖掘。除此之外，-5 429 ～-6 036 bp之間也出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性顯著變化，但此區(qū)域并未發(fā)現(xiàn)Motif的分布，說(shuō)明這有可能是豬特有的調(diào)控區(qū)域。

目前研究發(fā)現(xiàn)，PAX3、SOX10、CREB等轉(zhuǎn)錄因子和典型的WNT3A信號(hào)通路都能夠調(diào)控MITF-M的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[19-20]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了KLF4與MITF-M的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系。KLF4(Kruppel-like factor 4)作為真核生物轉(zhuǎn)錄因子，是一種在人類多種組織中廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育等重要生命過(guò)程[21]。KLF4是一個(gè)雙重功能轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)不同的靶基因，通過(guò)不同的機(jī)制，既可以激活又可以抑制轉(zhuǎn)錄作用。但KLF4在不同的腫瘤中是作為癌基因或腫瘤抑制因子起作用的[22]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在小鼠黑色素瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子KLF4對(duì)MITF-M基因轉(zhuǎn)錄有抑制作用，符合前人的研究結(jié)果。同時(shí)KLF4是體細(xì)胞重編程過(guò)程中誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的重要誘導(dǎo)因子之一[23]，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)結(jié)合元件(GC盒、CACCC盒和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件)結(jié)合來(lái)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[24]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KLF4通過(guò)兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)來(lái)調(diào)控MITF-M轉(zhuǎn)錄活性，一個(gè)是近端(-1 140～-1 397 bp)的CACCC盒，一個(gè)是遠(yuǎn)端(-2 470～-3 753 bp)的GC盒，完全符合已有研究結(jié)果。除此之外，Peagaricano等[25]研究發(fā)現(xiàn)，KLF4的表達(dá)量與黑色素的生成有直接關(guān)系，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相結(jié)合可推測(cè)，KLF4通過(guò)抑制MITF-M的轉(zhuǎn)錄活性從而影響黑色素細(xì)胞的色素合成和沉積。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)了豬MITF-M基因3個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，2個(gè)正向調(diào)控區(qū)域，1個(gè)負(fù)向調(diào)控區(qū)域，還確定了KLF4抑制MITF-M轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步研究MITF-M基因調(diào)控豬毛色的分子遺傳機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。