凌笑笑，唐 朋,2，賈聰俊，梁春年，吳曉云，褚 敏，閻 萍*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050； 2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，蘭州 730050)

骨骼肌約占軀體重量的40%，具有維持機(jī)體能量需求、保持姿勢(shì)和保護(hù)軟組織等功能。骨骼肌正常發(fā)育是動(dòng)物維持正常生命活動(dòng)與代謝的先決條件，任何非正常發(fā)育都會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生，如肌營(yíng)養(yǎng)不良、肌萎縮、肌肉肥大等，極大地降低動(dòng)物的生產(chǎn)性能。了解骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳因子以及相關(guān)信號(hào)通路，可為更好地預(yù)防、治療肌肉疾病和提高畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益奠定基礎(chǔ)。骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)長(zhǎng)期且復(fù)雜的生理過(guò)程，可將其大體分為4個(gè)階段，主要包括位于生皮肌節(jié)中的生肌前體細(xì)胞增殖，成肌細(xì)胞形成、增殖、分化和融合生成肌管，肌纖維和肌肉組織的形成[1]。骨骼肌的發(fā)育離不開(kāi)眾多因子的精準(zhǔn)調(diào)控，許多與細(xì)胞增殖、分化、再生、遷移和凋亡相關(guān)基因相互作用，形成一個(gè)復(fù)雜而精確的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)維持骨骼肌正常的形態(tài)以及收縮功能。以往研究表明，miRNAs作為重要的調(diào)控因子在骨骼肌發(fā)育、肌纖維形態(tài)和結(jié)構(gòu)的維持以及肌細(xì)胞生存等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。

miRNAs是一類長(zhǎng)度為18～22 nt的非編碼小RNA，其通過(guò)與靶mRNA 3′ UTR堿基互補(bǔ)配對(duì)調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其功能[3-4]。目前，大量報(bào)道表明，miRNAs參與調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖與分化。miR-98通過(guò)直接對(duì)E2F5(轉(zhuǎn)錄抑制因子)的調(diào)控參與到骨骼肌細(xì)胞的分化過(guò)程[5]。miR-374b 可以直接靶向MYF6，抑制C2C12細(xì)胞的分化。miR-140-3p通過(guò)抑制myomaker的表達(dá)，抑制成肌細(xì)胞融合與分化[6]。miR-151-3p通過(guò)抑制ATP2a2表達(dá)來(lái)調(diào)控慢肌基因的表達(dá)[7]。miR-30-5p可以靶向MBNL調(diào)控肌肉分化[8]。miR-128靶向MSTN(肌生成抑制素)，促進(jìn)肌細(xì)胞增殖，抑制其分化[9]。越來(lái)越多的研究表明，miR-487b-3p參與多種生命活動(dòng)的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，miR-487b-3p作為抑癌基因抑制多種腫瘤增殖、遷移和侵襲[10-11]。近年來(lái)也有研究表明，miR-487b-3p抑制C2C12成肌細(xì)胞的分化[12]。但miR-487b-3p影響骨骼肌發(fā)育的具體機(jī)制卻少有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)在小鼠C2C12成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和抑制miR-487b-3p，探究miR-487b-3p對(duì)細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控作用。

Wnt信號(hào)通路是參與肌肉發(fā)育的一個(gè)重要通路，PITX2作為Wnt信號(hào)通路上的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與生物體的早期發(fā)育進(jìn)程[13-14]。有研究表明，PITX2是眼外肌生成的激活劑，參與調(diào)控眼肌發(fā)育[15-16]。Kumar和Moses[17]研究發(fā)現(xiàn)，PITX2參與細(xì)胞定型與特化過(guò)程，對(duì)生物體的遺傳發(fā)育具有重要作用，還有大量研究表明，PITX2在多種組織器官的形成中發(fā)揮重要作用[18-20]，推測(cè)其可能參與骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。Lozano-Velasco等[14]研究表明，PITX2可通過(guò)下調(diào)miR-15b、miR-23b、miR-106b、miR-503促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，PITX2-微小RNA(miRNA)途徑還可以促進(jìn)早期活化的衛(wèi)星細(xì)胞增殖，增強(qiáng)MYF5基因的表達(dá)，促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞定向分化為生肌細(xì)胞。MYOD基因是控制骨骼肌發(fā)生的核心調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的一部分，并且是肌細(xì)胞命運(yùn)的基本決定因素，PITX2通過(guò)與MYOD核心增強(qiáng)子的直接結(jié)合激活肢體肌肉前體細(xì)胞中的MYOD基因[21]。綜上推測(cè)PITX2參與肌肉發(fā)育的調(diào)控。

本研究利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-487b-3p與PITX2的靶標(biāo)關(guān)系，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來(lái)驗(yàn)證這種關(guān)系。探究miR-487b-3p在小鼠C2C12成肌細(xì)胞增殖和分化中的作用及可能的分子機(jī)制，為后期家畜肌肉發(fā)育機(jī)理研究和產(chǎn)肉性能的改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

C2C12成肌細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；Dual-Luciferase Reporter Gene Assay Kit雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biovision公司(美國(guó))；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶、青/鏈霉素雙抗均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；miRNA mimics、inhibitor、negative control、inhibitor negative control均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；miRNeasy Mini Kit總RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購(gòu)自TaKaRa大連寶生物公司；CCK-8、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗PCNA、一抗MYOD、一抗MYOG、一抗MYHC、一抗β-actin和二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 小鼠miR-487b-3p靶基因預(yù)測(cè)

利用miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)和miRDB(http://www.mirdb.org/)對(duì)miR-487b-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，查閱大量相關(guān)文獻(xiàn)后，篩選出與肌肉發(fā)育相關(guān)的靶基因PITX2。

1.3 構(gòu)建小鼠miR-487b-3p靶基因的突變型與野生型載體

本研究選擇pmirGLO Vector(Promega)作為載體骨架，其載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。構(gòu)建重組載體時(shí)，首先得到靶基因PITX2與miR-487b-3p的結(jié)合位點(diǎn)，并獲取包括結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的70 bp的PITX2 3′ UTR，此序列為野生型序列，而突變序列是把預(yù)測(cè)可能結(jié)合的位點(diǎn)突變成它的反向互補(bǔ)序列，具體信息見(jiàn)圖2。堿基合成后直接將其連入載體質(zhì)粒中，通過(guò)測(cè)序以驗(yàn)證序列的準(zhǔn)確性。

圖1 pmirGLO載體圖
Fig.1 Map of pmirGLO vector

1.4 小鼠C2C12細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠C2C12細(xì)胞從液氮中取出，迅速置于37 ℃水浴中使其快速融化，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。

斜體部分為小鼠PITX2 3′ UTR突變型與野生型載體的差異堿基序列
Italic parts represent the different sequences between wild-type(WT) and mutant-type(MT) vectors of mouse PITX2 3′ UTR(mut)
圖2 PITX2 3′ UTR野生型與突變型載體序列信息
Fig.2 The sequence information of wild-type and mutant-type vectors of PITX2 3′ UTR

用完全培養(yǎng)基(10% FBS和90% DMEM)重懸細(xì)胞懸液至適當(dāng)接種濃度，放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)12、24、36和48 h觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并拍照，同時(shí)提取各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞總RNA。

當(dāng)C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)至90%以上匯合度時(shí)，采用血清撤離方法誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞成肌分化。棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞1次，加入分化培養(yǎng)基(2%馬血清和98% DMEM)，記為D0天，每天更換1次培養(yǎng)基，在分化培養(yǎng)的D0、D1、D3、D5、D7分別收取細(xì)胞，用于熒光定量PCR檢測(cè)不同分化階段miR-487b-3p及相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì)。

1.5 小鼠C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性分析

1.5.1 miR-487b-3p mimics(inhibitor)單轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d取生長(zhǎng)旺盛的C2C12細(xì)胞，經(jīng)清洗、胰酶消化和離心后，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，傳代于6孔板(5× 104)或96孔板(2×103)中，輕輕晃動(dòng)板子，使細(xì)胞均勻分布。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右密度時(shí)，將培養(yǎng)基更換為OPTI-DMEM(無(wú)血清培養(yǎng)基)，饑餓細(xì)胞4 h，然后將miR-487b-3p mimics(M)、miR-487b-3p inhibitor(I)、Mimics Negative Control(MNC)、Inhibitor Negative Control(INC)與OPTI-DMEM混合，lip 3000與OPTI-DMEM混合，靜置5 min，將兩者輕輕混勻后室溫靜置20 min，逐滴加入培養(yǎng)基使mimics或MNC(inhibitor或INC)轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol·L-1(100 nmol·L-1)。

1.5.2 載體pmir-PITX2與miR-487b-3p mimics共轉(zhuǎn)染 將C2C12細(xì)胞接種至24孔板，待細(xì)胞密度達(dá)70%左右。利用lip 3000將miR-487b-3p mimics和雙熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12 h后更換為完全培養(yǎng)基(10% FBS+90% DMEM)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染試驗(yàn)分為4個(gè)組：miR-487b-3p mimics+pmir-PITX2-3′ UTR -WT；MNC+pmir-PITX2-3′ UTR-WT；miR-487b-3p mimics+pmir-PITX2-3′ UTR-MT；MNC+pmir-PITX2-3′ UTR-MT。

1.5.3 雙熒光素酶活性檢測(cè) 按照Dual-Luciferase Reporter Gene Assay Kit(Biovision)說(shuō)明書向每孔中加入適量細(xì)胞裂解液，室溫孵育10 min；10 000 g離心5 min，取上清作為待測(cè)液；取100 μL待測(cè)液加入96孔發(fā)光板中，加入100 μL螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)工作液，吹吸混勻；放入化學(xué)發(fā)光儀(中生北控BK-L96C)測(cè)定發(fā)光值，積分時(shí)間5 s，得到螢火蟲(chóng)熒光素酶活性值；加入海腎熒光素酶檢測(cè)工作液100 μL，吹打混勻，上機(jī)測(cè)定發(fā)光值，積分時(shí)間5 s，得到海腎熒光素酶活性值。

1.6 CCK-8法檢測(cè)小鼠C2C12細(xì)胞增殖情況

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12成肌細(xì)胞均勻接種到96孔板中，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，并在4個(gè)空孔中加入等量培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。在轉(zhuǎn)染后12、24、36、48、72 h分別從培養(yǎng)箱中取出一個(gè)96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液(盡量不要產(chǎn)生氣泡，否則影響OD值讀數(shù))，孵育1～2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD值，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)小鼠miR-487b-3p和相關(guān)目的基因的表達(dá)

1.7.1 小鼠miR-487b-3p和相關(guān)目的基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)獲得小鼠miR-487b-3p成熟序列，設(shè)計(jì)miR-487b-3p特異性熒光定量引物；登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得目的基因mRNA序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的特異性熒光定量引物。引物序列見(jiàn)表1，由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。

1.7.2 小鼠miR-487b-3p和目的基因的qRT-PCR分析 根據(jù)miRNeasy Mini Kit(Qiagen)說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的完整性和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行miRNA和mRNA反轉(zhuǎn)錄，并將得到的cDNA產(chǎn)物作為qRT-PCR的模板，檢測(cè)miR-487b-3p和目的基因的表達(dá)情況。

表1qRT-PCR引物序列

Table1ThesequencesofqRT-PCRprimers

基因Gene引物序列(5′→3′)Sequence退火溫度/℃TmmiR-487b-3pF:AATCGTACAGGGTCATCCACTTR:TGCAGGTCAACTGGTGTCGT60U6F:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAATR: CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT60PCNAF:TATGCCGAGACCTTAGCCAR:CGCCTCCTCTTCTTTATCCA60MYODF:CGCAACGCCATCCGCTACATR:GGTGTCGTAGCCATTCTGCCG60MYOGF:AGCGGCTGCCTAAAGTGGAGAR:TTGTGGGCGTCTGTAGGGTCA60MYHCF:GGAAGTATGAGCGGCGTGTTAR:GGGCTTTCCTGAACTTGGTG60GAPDHF:GCTGCCCAGAACATCATCCCTR:CCTCAGATGCCTGCTTCACCA60PITX2F: CAACCTTACGGAAGCCCGAGTCR: TGGTGGACAGAGACGCTGACG60

1.8 蛋白免疫印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

將C2C12細(xì)胞培養(yǎng)板(6孔板)從培養(yǎng)箱中取出，PBS清洗2次，加入適量含1% PMSF的RIPA裂解液(碧云天)，冰上放置30 min，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，12 000 g，4 ℃離心15 min，小心吸取上清，分裝后-80 ℃保存。根據(jù)目的蛋白的大小配制相應(yīng)濃度分離膠，濃縮膠濃度一般為5%。取出蛋白溶液置于冰上解凍，采用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)測(cè)定蛋白濃度，隨后調(diào)整至同一濃度。加入5×SDS上樣緩沖液，封口膜封好后100 ℃煮沸10 min，冷卻后加入到膠孔中，在80 V恒壓下緩慢電泳至濃縮膠與分離膠界面，然后120 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)跑至膠底部，開(kāi)始轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜前PVDF膜置于甲醇中浸泡活化2 min，海綿和濾紙置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中備用。根據(jù)目的蛋白大小進(jìn)行切膠，并按照海綿、濾紙、膠、PVDF膜、濾紙和海綿的三明治緊密排列順序恒流轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，并將其放入5% BSA中，室溫封閉1～2 h(根據(jù)抗體而定)。隨后將PVDF膜放入一定配比的一抗孵育液中，4 ℃過(guò)夜。TBST搖動(dòng)洗膜3次，每次10 min。加入HRP標(biāo)記二抗孵育液，室溫放置60 min。倒掉二抗，TBST搖動(dòng)洗膜3次，每次10 min。膜上滴加ECL顯影液，待膜表面全部被顯影液覆蓋，置于FluorChem R多功能成像分析系統(tǒng)中曝光并拍照。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用相對(duì)定量的方法，分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct法計(jì)算miR-487b-3p和相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。雙熒光素酶活性采用螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性比值計(jì)算。所有數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次，以SPSS 21.0軟件中雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P<0.05為顯著水平。采用數(shù)據(jù)分析軟件GraphPad Prism 5.0作圖。

2 結(jié) 果

2.1 miR-487b-3p小鼠組織表達(dá)譜檢測(cè)

qRT-PCR檢測(cè)miR-487b-3p在小鼠各組織中的表達(dá)情況，如圖3所示，miR-487b-3p在小鼠各個(gè)組織中廣泛表達(dá)，骨骼肌中相對(duì)表達(dá)最高，其次是脂肪。推測(cè)miR-487b-3p在小鼠骨骼肌中發(fā)揮重要作用。

H. 心；L1. 肝；S. 脾；L2. 肺；K. 腎；M. 骨骼??；F. 脂肪
H. Heart；L1. Liver；S. Spleen；L2. Lung；K. Kidney；M. Skeletal muscle；F. Fat
圖3 miR-487b-3p在小鼠不同組織中的表達(dá)
Fig.3 Expression of miR-487b-3p in mouse different tissues

2.2 小鼠miR-487b-3p在C2C12細(xì)胞增殖過(guò)程中的表達(dá)

顯微鏡下觀察同一區(qū)域C2C12細(xì)胞在增殖不同時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)學(xué)變化。如圖4所示，在C2C12細(xì)胞增殖過(guò)程中，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，增殖48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)融合趨勢(shì)。qRT-PCR檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)(圖5)，隨著C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間增加，miR-487b-3p表達(dá)量均逐漸升高。與12 h相比，miR-487b-3p在48 h 表達(dá)量極顯著上升(P<0.01)。

2.3 小鼠miR-487b-3p在C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)

C2C12細(xì)胞在分化不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化如圖6所示。隨著誘導(dǎo)天數(shù)的不斷增加，肌管形成越來(lái)越明顯。誘導(dǎo)分化1 d后，細(xì)胞開(kāi)始縱向分布，有少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)融合現(xiàn)象；3 d后出現(xiàn)較多的多核肌管，單核細(xì)胞變少；5 d后肌管變粗變長(zhǎng)，分化明顯。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示(圖7)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，MYHC表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。

圖4 C2C12成肌細(xì)胞在增殖過(guò)程中的形態(tài)變化(100×)
Fig.4 Morphological changes of C2C12 myoblasts during proliferation(100×)

*.差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)。下同
* indicate significant difference(P<0.05)，** indicate extremely significant difference(P<0.01).The same as follows
圖5 miR-487b-3p在C2C12成肌細(xì)胞增殖過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)
Fig.5 Expression of miR-487b-3p during C2C12 myoblasts
proliferation

與D0相比，MYHCmRNA表達(dá)量在D3、D5和D7均極顯著升高(P<0.01)。以上結(jié)果顯示，體外成功誘導(dǎo)小鼠C2C12成肌細(xì)胞分化。

利用qRT-PCR檢測(cè)miR-487b-3p在分化D0、D1、D3、D5和D7的表達(dá)模式。qRT-PCR結(jié)果顯示(圖8)，隨著分化的進(jìn)程，miR-487b-3p在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。與D0相比，C2C12細(xì)胞在D7中miR-487b-3p的表達(dá)量極顯著上升(P<0.01)，推測(cè)miR-487b-3p對(duì)C2C12成肌細(xì)胞的分化可能具有重要調(diào)控作用。

2.4 小鼠C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics(inhibitor)12 h后，更換為10% FBS的完全培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞提取總RNA，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，如圖9所示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染mimics組miR-487b-3p的表達(dá)量極顯著上升(P<0.01)，而inhibitor組miR-487b-3p的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。

圖6 C2C12成肌細(xì)胞在分化過(guò)程中的形態(tài)變化(400×)
Fig.6 Morphological changes of C2C12 myoblasts during differentiation(400×)

圖7 C2C12細(xì)胞分化狀態(tài)下MYHC的表達(dá)趨勢(shì)
Fig.7 Expression of MYHC during C2C12 myoblasts differentiation

圖8 miR-487b-3p在C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)
Fig.8 Expression of miR-487b-3p during C2C12 myoblasts differentiation

圖9 轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)
Fig.9 The detection of transfection efficiency

2.5 小鼠miR-487b-3p促進(jìn)C2C12成肌細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics(inhibitor)12 h后，更換為10% FBS的完全培養(yǎng)基，此時(shí)記為0 h，36 h后收集細(xì)胞提取總RNA和總蛋白，檢測(cè)增殖標(biāo)志基因PCNA的表達(dá)變化。如圖10～12所示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-487b-3p組細(xì)胞PCNA在mRNA和蛋白水平均極顯著上升(P<0.01)；而抑制miR-487b-3p使PCNA在mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.01)水平顯著降低。CCK-8結(jié)果顯示(圖13)，與對(duì)照相比，miR-487b-3p mimics處理48 h 后顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，miR-487b-3p mimics組細(xì)胞在450 nm處的OD值極顯著增加(P<0.01)；與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor組細(xì)胞在培養(yǎng)36 h后生長(zhǎng)受到抑制，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用顯著(P<0.05)。綜上可知，過(guò)表達(dá)miR-487b-3p促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖。

2.6 小鼠miR-487b-3p抑制C2C12細(xì)胞分化

轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics(inhibitor)12 h后，更換為生長(zhǎng)培養(yǎng)基(10% FBS，90% DMEM)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞密度達(dá)到90%左右時(shí)，更換分化培養(yǎng)基(2%馬血清，98% DMEM)，此時(shí)記為0 h，96 h后收集細(xì)胞提取總RNA和總蛋白，檢測(cè)分化標(biāo)志基因MYHC、MYOD和MYOG的表達(dá)變化。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖14所示，過(guò)表達(dá)miR-487b-3p后，MYOD、MYHC和MYOG在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)；抑制miR-487b-3p后，MYOD、MYHC和MYOGmRNA的表達(dá)量增加，但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示(圖15～16)，過(guò)表達(dá)miR-487b-3p組顯著抑制MYHC(P<0.05)、MYOD(P<0.01)、MYOG(P<0.05)蛋白表達(dá)；而抑制miR-487b-3p組顯著增加MYOD、MYHC和MYOG蛋白表達(dá)量(P<0.05)。

圖10 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics、inhibitor后C2C12細(xì)胞中PCNA的表達(dá)情況
Fig.10 Expression of PCNA in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p mimics, inhibitor

A.轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics后，C2C12細(xì)胞中PCNA蛋白Western blotting檢測(cè)；B. 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics后，C2C12細(xì)胞中PCNA蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)
A shows the Western blotting analysis of PCNA protein in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p mimics; B shows the expression level of PCNA protein detected by Western blotting after miR-487b-3p mimics transfecting into C2C12 cells
圖11 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics后C2C12細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)檢測(cè)
Fig.11 Western blotting analysis of PCNA in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p mimics

A.轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor后，C2C12細(xì)胞中PCNA蛋白Western blotting檢測(cè)；B. 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor后，C2C12細(xì)胞中PCNA蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)
A shows the Western blotting analysis of PCNA protein in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p inhibitor; B shows the expression level of PCNA protein detected by Western blotting after miR-487b-3p inhibitor transfecting into C2C12 cells
圖12 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor后C2C12細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)檢測(cè)
Fig.12 Western blotting analysis of PCNA in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p inhibitor

圖13 CCK-8檢測(cè)miR-487b-3p mimics、inhibitor對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響
Fig.13 Effect of miR-487b-3p mimics, inhibitor on C2C12 cells proliferation by CCK-8 test

圖14 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics、inhibitor后C2C12細(xì)胞中分化標(biāo)記基因的表達(dá)情況
Fig.14 Expression of differentiation marker genes in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p mimics, inhibitor

A.轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics后，C2C12細(xì)胞中分化相關(guān)蛋白Western blotting檢測(cè)；B. 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics后，C2C12細(xì)胞中分化相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)
A shows the Western blotting analysis of differentiation-related proteins in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p mimics; B shows the expression levels of differentiation-related proteins detected by Western blotting after miR-487b-3p mimics transfecting into C2C12 cells
圖15 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics后C2C12細(xì)胞中分化相關(guān)蛋白的表達(dá)情況
Fig.15 Expression of differentiation-related proteins in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p mimics

2.7 小鼠miR-487b-3p的靶基因預(yù)測(cè)

運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)小鼠miR-487b-3p的靶基因，結(jié)果顯示，配對(duì)樣同源域轉(zhuǎn)錄因子2(paired-like homeodomain transcription factor 2，PITX2)基因的3′ UTR有miR-487b-3p的結(jié)合位點(diǎn)(圖17)。前期研究表明，PITX2作為Wnt信號(hào)通路中的調(diào)控因子，在多種組織器官的形成中發(fā)揮重要作用[18-20]，因此推測(cè)，PITX2有可能參與肌肉發(fā)育的調(diào)控。

2.8 小鼠miR-487b-3p的表達(dá)水平與靶基因PITX2的關(guān)系

為了確定miR-487b-3p與PITX2之間的關(guān)系，利用qRT-PCR初步驗(yàn)證miRNAs與預(yù)測(cè)的靶基因的表達(dá)量是否存在負(fù)相關(guān)。如圖18所示，在C2C12細(xì)胞增殖階段，PITX2的表達(dá)量處于一個(gè)較穩(wěn)定的水平，而在分化階段，PITX2表達(dá)量起伏較明顯，整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

如圖19所示，與MNC相比，過(guò)表達(dá)miR-487b-3p后PITX2 mRNA表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；將miR-487b-3p inhibitor轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞后，PITX2 mRNA表達(dá)量極顯著上升(P<0.01)。

A.轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor后，C2C12細(xì)胞中分化相關(guān)蛋白Western blotting檢測(cè)；B. 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor后，C2C12細(xì)胞中分化相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)
A shows the Western blotting analysis of differentiation-related proteins in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p inhibitor; B shows the expression levels of differentiation-related proteins detected by Western blotting after miR-487b-3p inhibitor transfecting into C2C12 cells
圖16 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor后C2C12細(xì)胞中分化相關(guān)蛋白的表達(dá)情況
Fig.16 Expression of differentiation-related proteins in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p inhibitor

圖17 miR-487b-3p與PITX2 3′ UTR的結(jié)合位點(diǎn)
Fig.17 The binding site of miR-487b-3p to PITX2 3′ UTR

A.PITX2在C2C12細(xì)胞增殖階段的表達(dá)；B. PITX2在C2C12細(xì)胞分化階段的表達(dá)
A. Expression of PITX2 during C2C12 cells proliferation; B. Expression of PITX2 during C2C12 cells differentiation
圖18 PITX2在C2C12成肌細(xì)胞增殖及分化過(guò)程中的表達(dá)模式
Fig.18 Expression patterns of PITX2 during the proliferation and differentiation of C2C12 myoblasts

2.9 C2C12細(xì)胞中驗(yàn)證miR-487b-3p的直接靶基因PITX2

如圖20所示，miR-487b-3p與野生型載體共轉(zhuǎn)染后檢測(cè)到熒光素酶活性(螢火蟲(chóng)熒光活性/海腎熒光活性比值)顯著降低(P<0.01)，而與突變型載體共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性與對(duì)照相比無(wú)顯著變化(P>0.05)， 綜上可知，miR-487b-3p靶向PITX2發(fā)揮其功能。

圖19 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics、inhibitor后PITX2 mRNA相對(duì)表達(dá)量
Fig.19 The relative expression of PITX2 mRNA after transfection of miR-487b-3p mimics, inhibitor

WT.野生型；MT.突變型
WT. Wild type; MT. Mutant type
圖20 miR-487b-3p與PITX2作用關(guān)系分析
Fig.20 The relationship analysis between miR-487b-3p and PITX2

3 討 論

骨骼肌發(fā)育離不開(kāi)成肌細(xì)胞的增殖和分化這兩個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程，探討miRNAs對(duì)骨骼肌細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控是研究骨骼肌發(fā)育的核心內(nèi)容。其中MYOD調(diào)控骨骼肌干細(xì)胞定向分化為成肌細(xì)胞，參與成肌分化的初始階段，MYOG和MYHC主要調(diào)控成肌細(xì)胞分化為肌纖維和肌肉組織，參與成肌分化的終末階段[22]。目前，關(guān)于miRNAs對(duì)成肌細(xì)胞分化的調(diào)控研究中，均采用MYOD、MYOG和MYHC基因的表達(dá)量來(lái)反映成肌細(xì)胞分化程度，進(jìn)而確定miRNAs對(duì)成肌細(xì)胞分化的具體作用機(jī)制[23-25]。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是一個(gè)同源三聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與許多分子互作共同參與DNA代謝各個(gè)方面的調(diào)控，包括DNA復(fù)制、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和染色質(zhì)重塑，其表達(dá)量直接反映細(xì)胞增殖情況[26]。因此，本試驗(yàn)通過(guò)獲得性和缺失性研究將外源miR-487b-3p mimics和inhibitor分別導(dǎo)入小鼠C2C12細(xì)胞，通過(guò)比較MYOD、MYOG和MYHC基因表達(dá)量分析不同處理組C2C12成肌細(xì)胞的分化程度，比較PCNA基因的表達(dá)量來(lái)分析C2C12細(xì)胞增殖情況進(jìn)而確定miR-487b-3p在骨骼肌發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-487b-3p顯著提高增殖標(biāo)記基因PCNA的表達(dá)量，降低分化標(biāo)記基因MYOD、MYOG和MYHC的表達(dá)水平；而抑制miR-487b-3p則降低PCNA的表達(dá)，促進(jìn)MYOD、MYOG和MYHC的表達(dá)。可見(jiàn)，miR-487b-3p促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖但抑制其分化。這與Katase等[12]的研究結(jié)果相一致。對(duì)癌癥的研究發(fā)現(xiàn)，miR-487b-3p可抑制多種類型癌細(xì)胞增殖[10-11]。推測(cè)miR-487b-3p在不同生理過(guò)程中發(fā)揮不同作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-487b-3p在小鼠體內(nèi)各個(gè)組織均有表達(dá)，說(shuō)明miR-487b-3p廣泛參與到小鼠的各項(xiàng)生命活動(dòng)，且在小鼠C2C12成肌細(xì)胞增殖與分化過(guò)程中存在差異表達(dá)。由此，筆者推測(cè)miR-487b-3p可能參與骨骼肌細(xì)胞的發(fā)育。在C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中，隨著分化的進(jìn)程，miR-487b-3p的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在分化第1天表達(dá)量降低可能是由于細(xì)胞間接觸，增殖受到抑制，分化第5天miR-487b-3p表達(dá)量低于第3天可能是由于分化較明顯的狀態(tài)導(dǎo)致其他信號(hào)通路激活，影響其表達(dá)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

miRNAs主要通過(guò)與靶基因3′ UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)來(lái)降解靶基因或抑制其翻譯，完成對(duì)靶基因的調(diào)控，來(lái)影響靶基因所在的相關(guān)通路，進(jìn)而參與調(diào)控動(dòng)物體生長(zhǎng)發(fā)育、代謝及癌癥發(fā)生，因此準(zhǔn)確篩選miRNAs作用的靶基因?qū)τ诔浞至私鈓iRNAs的功能具有十分重要的意義。本研究預(yù)測(cè)與肌肉發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路上的PITX2為miR-487b-3p的靶基因，推測(cè)其可能參與骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。本研究利用qRT-PCR檢測(cè)小鼠C2C12細(xì)胞增殖與分化中和過(guò)表達(dá)(抑制)miR-487b-3p后PITX2基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)PITX2與miR-487b-3p表達(dá)趨勢(shì)相反，進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-487b-3p和PITX2的靶向關(guān)系。可見(jiàn)，miR-487b-3p通過(guò)靶向PITX2參與調(diào)控C2C12細(xì)胞增殖與分化。Katase等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-487b-3p通過(guò)靶向Wnt3a和Wnt5a參與調(diào)控C2C12細(xì)胞成肌分化，與本研究結(jié)果不同，可能是由于一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因共同完成對(duì)骨骼肌發(fā)育的調(diào)控。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，miR-487b-3p在小鼠各組織均有表達(dá)，其在骨骼肌中相對(duì)表達(dá)最高。miR-487b-3p過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-487b-3p促進(jìn)小鼠C2C12細(xì)胞增殖但抑制其分化。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-487b-3p通過(guò)靶向PITX2參與骨骼肌發(fā)育的調(diào)控。