劉潔 曾燁 周玨宇 陳志超 張漢榮 賴姝彧 吳小麗 譚令梅 王雪飛

[摘要] 目的 探討miR-519d對(duì)人宮頸癌細(xì)胞中CDKN1A/p21基因的靶向調(diào)控作用以及對(duì)細(xì)胞增殖、周期的影響。方法 通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-519d抑制物對(duì)其活性的調(diào)控作用。在宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞中下調(diào)miR-519d表達(dá)，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的分布情況。將miR-519d mimic轉(zhuǎn)染HeLa和SiHa細(xì)胞，用熒光定量PCR、Western Blot分別檢測(cè)p21 mRNA和蛋白水平的表達(dá)。利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)確認(rèn)miR-519d與p21的靶向關(guān)系。 結(jié)果 miR-519d抑制物能有效下調(diào)宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞內(nèi)miR-519d的表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期分析結(jié)果提示，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-519d的表達(dá)能夠顯著降低細(xì)胞增殖活力，并使細(xì)胞周期阻滯于G1期。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)鑒定miR-519d能夠結(jié)合p21 mRNA 3′UTR有效抑制其表達(dá)。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，過表達(dá)miR-519d能在mRNA和蛋白水平上抑制p21的表達(dá)。 結(jié)論 p21是miR-519d的直接靶基因，miR-519d可能通過靶向p21調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖。

[關(guān)鍵詞] 微小RNA；宮頸癌；p21；細(xì)胞周期

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）21-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the role of miR-519d in the targeted regulation of CDKN1A/p21 gene in human cervical cancer cells and its effect on cell proliferation and cell cycle. Methods The effect of miR-519d inhibitor on its activity was detected by fluorescence quantitative PCR. The miR-519d expressions in cervical cancer cell HeLa and SiHa were down-regulated. The cell proliferation abilitywas detected by MTT assay， and cell cycle distribution was detected by flow cytometry. MiR-519d mimic was transfected into HeLa and SiHa cells， and the expression of p21 mRNA and protein was detected by fluorescence quantitative PCR and Western Blot， respectively. A dual luciferase reporter gene system was used to confirm the targeting relationship between miR-519d and p21. Results The miR-519d inhibitor can effectively down-regulate the expression of miR-519d in HeLa and SiHa cells of cervical cancer. The results of MTT assay and cell cycle analysis suggested that the down-regulation of miR-519d expression in cells could significantly reduce cell proliferation and arrest cell cycle at G1 phase. Further the dual luciferase reporter system identified that miR-519d was able to in combination with p21 mRNA 3'UTR and effectively inhibit the expression of p21. The results of qRT-PCR and Western blot showed that overexpression of miR-519d inhibited the expression of p21 at mRNA and protein levels. Conclusion p21 is a direct target gene of miR-519d， and miR-519d may regulate the proliferation of cervical cancer cells by targeting p21.

[Key words] MicroRNA； Cervical cancer； p21； Cell cycle

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一種大小約21～25個(gè)堿基的單鏈小分子非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，它可以通過與特定mRNA結(jié)合或調(diào)控特定mRNA的蛋白質(zhì)翻譯而影響基因表達(dá)。近年來，大量研究表明miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色。miR-519d是我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的RNA分子[1]，其定位于第19號(hào)染色體19q13.41區(qū)，是人體內(nèi)最大的miRNA基因簇C19MC所在位置，最早發(fā)現(xiàn)它能抑制過氧化物酶體增殖物激活受體，引起脂肪酸代謝紊亂，與肥胖相關(guān)[2]。最近研究表明，miR-519d參與調(diào)控肝癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等[3-7]腫瘤中發(fā)生發(fā)展，與其診斷和預(yù)后有關(guān)。然而，它在宮頸癌進(jìn)展中究竟扮演何種角色及其具體機(jī)制，仍有待闡明。本研究中，我們利用miR-519d inhibitor干擾宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞內(nèi)miR-519d的表達(dá)，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，綜合表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，明確靶基因CDKN1A/p21，以揭示miR-519d促進(jìn)宮頸癌增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（高糖）、Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000、Superscrpt Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、雙鏈cDNA合成試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，RNeasy mini試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，Trizol試劑、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、psi-CHECK-2質(zhì)粒DNA購(gòu)自美國(guó)Promega公司。miR-519d模擬物mimic、抑制物inhibitor以及NC均由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。熒光定量PCR引物由華大基因合成。四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）等購(gòu)自Sigma公司。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司。p21、GAPDH蛋白抗體購(gòu)自Abcam公司。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自上海Thermo Fisher公司，ND-1000紫外分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)NanoDrop公司，ABI 7500熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，GloMax生物發(fā)光檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Promega公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)BD公司，SDS-PAGE垂直電泳槽、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HeLa、SiHa細(xì)胞均培養(yǎng)于含有10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染過程如下：將小分子RNA（inhibitor/mimic或NC）稀釋于200 μL Opti-MEM中，輕敲管壁混勻；每管加入5 μL轉(zhuǎn)染試劑，輕敲管壁混勻，室溫放置20 min，將RNA/Lipofectamin復(fù)合物加入2 mL的細(xì)胞稀釋液，混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)板，根據(jù)需要于轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。以上宮頸癌HeLa、SiHa細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.4 總RNA提取及熒光定量PCR

收集實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染miR-519d inhibitor/mimic）和陰性對(duì)照組（Negative control，NC）細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑說明書進(jìn)行總RNA的提取，隨后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作進(jìn)行cDNA的合成，分別用U6和GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)miR-519d及p21的表達(dá)情況，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)

先將細(xì)胞培養(yǎng)在96個(gè)孔中，每個(gè)孔中放入3000個(gè)細(xì)胞，隨后miR-519d inhibitor/NC轉(zhuǎn)染HeLa或SiHa細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h，在每孔中加入20 μL的MTT溶液（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩混勻10 min后置于酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)時(shí)每孔的吸光度A值以反映細(xì)胞生長(zhǎng)活力。

1.6細(xì)胞周期檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48 h后收集各組HeLa和SiHa細(xì)胞，用預(yù)冷的75%乙醇混勻4℃固定過夜，離心收集細(xì)胞，用200 μL的PBS重懸細(xì)胞并避光用PI孵育20 min，經(jīng)BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期的變化。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)

48 h后收集各組轉(zhuǎn)染后HeLa和SiHa細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞中總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。每組上樣30 μg總蛋白經(jīng)行10%的SDS-PAGE凝膠，恒壓電泳，恒流200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，室溫封閉1 h，加入p21一抗，4℃孵育p21和GAPDH一抗過夜，加入二抗，室溫孵育l h，洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光顯影，曝光掃描拍照。用Quantity One軟件分析各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中p21蛋白相對(duì)表達(dá)情況。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

通過上述Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)的miR-519d與候選靶基因p21的3′ UTR的結(jié)合部位，將野生型和突變型3′ UTR序列分別插入雙光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒 psi-CHECK-2中，從而獲得野生型（wt）和突變型（mt）的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，并經(jīng)測(cè)序鑒定。隨后，將野生型或突變型質(zhì)粒分別與miR-519d mimic或NC共轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞。待轉(zhuǎn)染48 h后收集且裂解細(xì)胞，使用Promega公司的雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定Renilla luciferase與firefly luciferase的活性，并計(jì)算各組中兩者的比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-519d抑制物對(duì)宮頸癌細(xì)胞內(nèi)miR-519d表達(dá)水平的影響

前期研究中發(fā)現(xiàn)miR-519d的表達(dá)在宮頸癌臨床組織標(biāo)本中高表達(dá)。因此，本項(xiàng)目擬采用miR-519d抑制物下調(diào)其活性以觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響。qRT-PCR結(jié)果顯示，與NC轉(zhuǎn)染組相比，宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞中miR-519d抑制物能顯著降低其表達(dá)，可作為后續(xù)活性調(diào)控的有效方法（P<0.05），見圖1。

2.2下調(diào)miR-519d活性對(duì)于宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響

MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-519d inhibitor對(duì)于宮頸癌細(xì)胞HeLa和SiHa增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-519d inhibitor轉(zhuǎn)染HeLa和SiHa細(xì)胞后能夠降低細(xì)胞生長(zhǎng)活力（圖2）。與NC組相比，轉(zhuǎn)染后24～96 h時(shí)段內(nèi)，miR-519d inhibitor能顯著降低HeLa及SiHa細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

2.3 下調(diào)miR-519d活性對(duì)于宮頸癌細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-519d inhibitor轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞后能阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。如圖3所示，與NC組相比，miR-519d inhibitor轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞后，G1期比例明顯升高，而S期細(xì)胞比例顯著下降（P<0.05），而G2/M期無明顯差異，說明下調(diào)miR-519d的活性可能通過影響細(xì)胞周期G1/S監(jiān)測(cè)點(diǎn)而發(fā)揮作用。

2.4 p21是miR-519d的直接靶基因

為了進(jìn)一步探討miR-519d影響宮頸癌細(xì)胞增殖、周期的具體機(jī)制，采用Targetscan等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)其靶基因，發(fā)現(xiàn)p21與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)，并根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的插入序列（圖4a）。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與NC組相比，HeLa和SiHa細(xì)胞中，miR-519d mimic可顯著抑制p21野生型3′ UTR的熒光素酶活性，而對(duì)種子序列突變型3′ UTR的熒光素酶活性沒有明顯的抑制作用（圖4b）。此外，宮頸癌細(xì)胞HeLa及SiHa中上調(diào)miR-519d的表達(dá)對(duì)p21的mRNA及蛋白水平均起到負(fù)性調(diào)控作用（圖4c、d）。上述結(jié)果證明了miR-519d能夠靶向作用于p21，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上抑制靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

3討論

宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。高危人乳頭瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR-HPV）感染是宮頸癌發(fā)生的必要因素。研究表明，HR-HPV表達(dá)的癌蛋白E6和E7，能分別結(jié)合并降解宿主細(xì)胞p53和RB家族蛋白，并通過一系列分子改變，引起細(xì)胞周期、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為改變，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生與進(jìn)展。然而，單純的HPV感染并不足以誘導(dǎo)宮頸癌的發(fā)生，提示必然有其他未知因素的協(xié)同作用[8]。

近年來，隨著miRNA功能研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明，其在宮頸癌中扮演著重要的角色，在腫瘤診斷、復(fù)發(fā)、預(yù)后評(píng)價(jià)中具有廣闊的應(yīng)用前景，有望成為宮頸癌診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)的新型標(biāo)志物以及臨床治療的新靶點(diǎn)。前期的研究中，我們?cè)贖eLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-519d的表達(dá)水平具有周期性，很可能與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)[1]。采用Targetscan軟件分析其序列發(fā)現(xiàn)，miR-106a/106b/17/20a/20b/93/519d具有相同的seed序列（AAAGUGC），說明它們可能具有相似的功能。而miR-106b家族（miR-106a/106b/17-5p/20a/20b）能夠靶向p21加速細(xì)胞通過G1/S關(guān)卡，發(fā)揮類似癌基因的功能[9]。此外，28種靶向p21的miRNAs中恰好包含上述miR-106b家族和miR-519d，且在絨癌JAR細(xì)胞中下調(diào)miR-519d可顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并將細(xì)胞阻滯于G1期[10]。Lehmann等[3]發(fā)現(xiàn)，與男性乳房增生癥患者相比，男性乳腺癌患者中miR-519d的表達(dá)明顯升高。然而，Deng等[11]關(guān)于其在乳腺癌中的作用恰恰相反。同樣地，對(duì)于肝癌中miR-519d的功能研究亦存在爭(zhēng)議，如Hou等[4]研究發(fā)現(xiàn)miR-519d能靶向MKi67在肝癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，而Fornari等[5]發(fā)現(xiàn)miR-519d在肝癌組織中高表達(dá)，能通過靶向p21、PTEN、AKT3、TIMP2而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲，抑制抗癌藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的功能。但近期Fornari等[12]再次報(bào)道循環(huán)血液中miR-519d的表達(dá)隨著肝硬化向早期肝癌、進(jìn)展期肝癌的演進(jìn)過程中逐步升高，這可能涉及miR-519d的胞外分泌機(jī)制。此外，miR-519d還能通過抑制TGF-β信號(hào)通路而促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞增殖[6]。Yue等[13]、Yang等[14]、Xie等[15]和Bai等[16]分別報(bào)道m(xù)iR-519d在胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌及肺腺癌中具有抑癌基因的功能，但Hua等[17]報(bào)道m(xù)iR-519d能促進(jìn)黑色素瘤的進(jìn)展，發(fā)揮癌基因的功能。上述研究充分說明，miR-519d的作用機(jī)制可能涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路，關(guān)于miR-519d在腫瘤中究竟扮演何種角色，可能涉及組織特異性的問題，相關(guān)領(lǐng)域值得進(jìn)一步關(guān)注，其具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

本研究證實(shí)miR-519d對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、周期具有明顯的調(diào)控作用后，利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到miR-519d的作用靶點(diǎn)，結(jié)合前期miR-519d的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，從中篩選到p21可能是其潛在靶基因，并對(duì)miR-519d靶向p21影響宮頸癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制展開了初步研究。p21是細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinases inhibitors，CDKIs）家族中的重要成員。它既與腫瘤抑制作用密切相關(guān)，又能通過抑制周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物的活性，協(xié)調(diào)細(xì)胞周期、DNA復(fù)制與修復(fù)之間的關(guān)系，從而將腫瘤抑制作用與細(xì)胞周期控制過程緊密相連。通過抑制cyclin D1-CDK4和cyclin E-CDK2的活性，使Rb蛋白不能磷酸化，E2F不能釋放，而使細(xì)胞周期停滯在G1期。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細(xì)胞中，上調(diào)miR-519d后，p21蛋白的表達(dá)水平顯著降低；下調(diào)miR-519d的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，并將細(xì)胞周期阻滯在G1期。

綜上所述，miR-519d可通過靶向p21基因，調(diào)控其蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而可能影響宮頸癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期等生物學(xué)行為，研究結(jié)果為進(jìn)一步完善宮頸癌的發(fā)病機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為宮頸癌的靶向治療提供新的線索。此外，患者循環(huán)血液中miR-519d的表達(dá)水平也是今后值得關(guān)注的一個(gè)研究?jī)?nèi)容。

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（收稿日期：2017-11-01）