呂昊陽 王巖 鞠禮 孫涵文 高益民 張明宇

[摘要] 目的 研究9p21染色體SNP rs10757278、干擾素α21（IFNα21）和冠心病發(fā)生之間的關(guān)系。 方法 連續(xù)選取200例冠脈造影患者，分為兩組，對照組100例：管壁光滑無動(dòng)脈硬化斑塊或血管狹窄<50%；實(shí)驗(yàn)組100例：冠脈造影血管狹窄>50%，檢測入組患者IFNα21蛋白濃度和9p21基因rs10757278（G）。 結(jié)果 rs10757278為AA時(shí) IFNα21濃度為（29.81±10.73）μg/L，rs10757278為AG時(shí)IFNα21濃度為（39.70±10.22）μg/L，rs10757278為GG時(shí) IFNα21濃度為（57.62±11.26）μg/L，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。早發(fā)冠心病組IFNα21濃度為（56.17±11.21）μg/L，相同年齡非冠心患者群IFNα21濃度為（48.63±10.31）μg/L，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 IFNα21蛋白的表達(dá)和rs10757278（G）風(fēng)險(xiǎn)等位基因呈劑量依賴關(guān)系，IFNα21蛋白濃度和早發(fā)冠心病的發(fā)生率之間呈正相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] SNP rs10757278；冠脈造影；干擾素α21蛋白；冠心病

[中圖分類號(hào)] R394.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）21-0012-04

[Abstract] Objective To study the relationship between 9p21 chromosome SNP rs10757278， interferon α21 （IFNα21） and coronary heart disease. Methods 200 patients with coronary angiography were consecutively selected and divided into two groups including control group and experimental group. 100 patients in the control group had smooth atherosclerotic plaque or vessel stenosis <50%. 100 patients in the experimental group had coronary angiography vascular stenosis>50%. The IFNα21 protein concentration and 9p21 gene rs10757278（G） of the patients were detected. Results The IFNα21 concentration was（29.81±10.73）μg/L when rs10757278 was AA. The IFNα21 concentration was（39.70±10.22）μg/L when rs10757278 was AG. And the IFNα21 concentration（57.62±11.26）μg/L when rs10757278 was GG. There was significant difference between groups（P<0.05）. The concentration of IFNα21 in premature coronary heart disease group was（56.17±11.21）μg/L， and the concentration of IFNα21 in non-coronary heart disease patients of the same age was（48.63±10.31）μg/L， and the difference between the two groups was statistically significant（P<0.05）. Conclusion There is a dose-dependent relationship between the expression of IFNα21 protein and the risk allele of rs10757278（G）， and there is a positive correlation between the concentration of IFNα21 protein and the incidence of premature coronary heart disease.

[Key words] SNP rs10757278； Coronary angiography； Interferon α21 protein； Coronary heart disease

冠心病是目前導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一。大量的全基因組關(guān)聯(lián)研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，冠心病具有一些相關(guān)聯(lián)的疾病易感基因多態(tài)性（SNP）[1-3]，這些SNP大多位于染色體9p21區(qū)域，但這些SNP改變導(dǎo)致冠心病發(fā)病率升高的具體作用機(jī)制尚不清楚。Harismendy等[4]研究認(rèn)為染色體9p21區(qū)域SNP通過干擾素α21（IFNα21）途徑導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化高發(fā)。本項(xiàng)目選取2014年1月～2014年12月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院心血管內(nèi)科進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影的患者，目的是研究SNP rs10757278、IFNα21和冠心病發(fā)生之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

連續(xù)選取2014年1月～2014年12月期間在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬四院心血管內(nèi)科住院并進(jìn)行冠脈造影的患者200例，排除標(biāo)準(zhǔn)：①外周血管疾病患者；②急性心肌梗死患者；③急性肺栓塞患者。根據(jù)冠脈造影結(jié)果將入組患者分為兩組：對照組100例：管壁光滑無動(dòng)脈硬化斑塊或血管狹窄<50%；實(shí)驗(yàn)組100例：冠脈造影血管狹窄>50%。入組病例采靜脈血5 mL，經(jīng)2000轉(zhuǎn)/min離心10 min取血清2 mL，在-80℃冰箱保存，等待進(jìn)一步檢驗(yàn)INFα21蛋白濃度、9p21基因rs10757278（G）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

首先在GeneBank中查詢并獲得染色體9p21基因SNP rs10757278的cDNA序列，參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)及合成。rs10757278的上游引物：5-TATTACAAATAGCTTCTCCACC-3；下游引物：5-TATTGTCTGCC-TTACATGTGCTAT-3；延伸引物：5-CGACTGTAGGTGCGTAACTCTGCGTCAA-ATCTAAGCT-GAGTGTTG-3。采用雙蒸水將DNA稀釋到濃度10 ng/μL，將PCR引物稀釋到最終濃度為10 μmol/L，再將延伸物稀釋到最終濃度為10 μmol/L。然后依次加入引物、dNTP、緩沖液、氯化鎂、Taq酶及稀釋后的DNA。對擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)進(jìn)行調(diào)控，將其設(shè)定為在95℃變性15 min，然后94℃變性30 s、55℃退火30 s、再72℃延伸1 min，以上擴(kuò)增步驟反復(fù)循環(huán)40次，最后將產(chǎn)物于4℃進(jìn)行保存。向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入純化液3 μL，并設(shè)置純化反應(yīng)條件為：37℃ 30 min，96℃ 10 min，后產(chǎn)物于4℃進(jìn)行保存。再向每個(gè)樣本中加入引物6 μL進(jìn)行反應(yīng)混合物的延伸，將反應(yīng)條件設(shè)置為96℃ 3 min，然后進(jìn)入94℃ 20 s，40℃ 10 s循環(huán)40次，產(chǎn)物于4℃進(jìn)行保存。取10 μL延伸物加入雜交板，在42℃進(jìn)行雜交，時(shí)間為2 h。通過SNP Stream基因分型系統(tǒng)來掃描分析。

采用ELISA方法測定IFNα21水平將保存的血清室溫溶解，將50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品孔中，將40 μL樣本稀釋液及10 μL血清加入樣本孔中。將100 μL檢測抗體用過氧化物酶標(biāo)記后加入樣本孔及標(biāo)準(zhǔn)品孔中，然后反應(yīng)孔用封板膜封住，在37℃恒溫箱保存60 min。棄去上清液，每孔加洗滌液至滿，放置2 min，甩去液體后在紙上拍干。重復(fù)操作5次上述步驟。將加入底物A 50 μL加入每孔中，然后再加入底物B 50 μL至孔中，避光在37℃條件下孵育15 min。于每孔加入終止液50 μL，在450 nm波長處測定各孔的OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖：應(yīng)用Excel工作表，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸曲線，通過曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

1.3 觀察指標(biāo)

rs10757278的堿基G表達(dá)，IFNα21蛋白的表達(dá)和冠心病發(fā)生之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0軟件，組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用多變量回歸分析IFNα21與早發(fā)冠心病的發(fā)生相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較

入選患者200例。根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果分為兩組，對照組100例，實(shí)驗(yàn)組100例，兩組之間低密度脂蛋白（LDL-C）、BMI、高血壓史、吸煙史、糖尿病史進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩組間LDL-C、吸煙史、高血壓病史及糖尿病病史同對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 IFNα21蛋白的表達(dá)和rs10757278（G）關(guān)聯(lián)性

IFNα21蛋白在純合子A基因型中表達(dá)最低，而在純合子G基因型中表達(dá)最高。通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFNα21蛋白的表達(dá)和rs10757278（G）風(fēng)險(xiǎn)等位基因成劑量依賴關(guān)系。見圖1。

2.3 IFNα21蛋白與早發(fā)冠心病相關(guān)性分析

在200例患者中符合早發(fā)冠心病診斷的共有39例為早發(fā)組，其中男23例（58.9%），女16例（41.1%）。在對照組中篩選與早發(fā)組年齡相近，共41例為對照組I，其中男19例（46.3%），女22例（53.7%）。采用多變量回歸分析校正LDL-C，吸煙史、高血壓病史、糖尿病史等變量。表2顯示：早發(fā)組的吸煙史、高血壓史、糖尿病史與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中高血壓患病率對照組Ⅰ高于早發(fā)組，而吸煙史率、糖尿病史率早發(fā)組高于對照組Ⅰ，結(jié)果分析：早發(fā)組低密度脂蛋白、IFNα21蛋白濃度與對照組Ⅰ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，早發(fā)組低密度脂蛋白、IFNα21蛋白濃度均高于對照組Ⅰ。我們發(fā)現(xiàn)IFNα21蛋白濃度和早發(fā)冠心病的發(fā)生率之間呈正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

3 討論

根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，我國心血管疾病患病率目前逐年上升，現(xiàn)階段患病總?cè)藬?shù)已達(dá)2.9億。冠心病是由基因因素和生活方式共同作用導(dǎo)致的多性狀復(fù)雜疾病，年齡、性別、吸煙、BMI指數(shù)、高血壓、高血脂和糖尿病等都是冠心病的易感因素，同時(shí)研究結(jié)果顯示冠心病受遺傳因素影響顯著[5-7]。目前大多數(shù)全基因組關(guān)聯(lián)研究是在歐美人群中進(jìn)行的[8]，其結(jié)果未必完全適用于中國人群，因此尋找和驗(yàn)證中國人群特異性與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的基因和位點(diǎn)，以及發(fā)現(xiàn)已報(bào)道位點(diǎn)在中國人群中是否具有不同的遺傳表現(xiàn)形式，是我們在冠心病分子遺傳學(xué)研究的重點(diǎn)之一。既往研究中顯示中國漢族人群中9p21區(qū)域中SNPrs10757278、rs1333040、rs2383207、rs10116277與冠心病易感性相關(guān)[9-11]，我們在先前實(shí)驗(yàn)也證實(shí)中國漢族人群SNP rs10757278中的G等位基因?yàn)楣谛牟』疾〉娘L(fēng)險(xiǎn)等位基因，AG及GG基因型為冠心病的危險(xiǎn)基因型，同時(shí)也有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)rs10757278和頸動(dòng)脈狹窄、猝死等多種動(dòng)脈硬化疾病相關(guān)[12，13]。

冠心病是屬于復(fù)雜疾病，特點(diǎn)是由多處基因突變而不是單一基因變異介導(dǎo)，每一個(gè)SNP對疾病的發(fā)生產(chǎn)生微小影響，但多個(gè)基因疊加到達(dá)閾值則導(dǎo)致冠心病的發(fā)生。所以SNP是通過那種生物學(xué)途徑影響其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，從而增加冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)仍是研究熱點(diǎn)[14]。Harismendy研究推測Ⅰ型干擾素參與9p21的染色體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，參與單核苷酸多態(tài)性對性狀的表達(dá)。根據(jù)IFNα21在不同人群中表達(dá)的測定結(jié)果，將其與rs10757278等位基因間進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)IFNα21蛋白在AA基因型中表達(dá)最低，而在GG基因型中表達(dá)最高。通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明IFNα21蛋白的表達(dá)和rs10757278（G）風(fēng)險(xiǎn)等位基因成劑量依賴關(guān)系，兩者呈正相關(guān)，那么SNPrs10757278造成冠心病高發(fā)是否是由IFNα21蛋白表達(dá)異常造成的？Glett等[15]以歐洲白種人為研究對象，通過對冠心病易感基因rs1333049作用的途徑研究，得出結(jié)論染色體造成冠心病高發(fā)不是由于Ⅰ型干擾素途徑所造成。Christopher等[16]研究也報(bào)道冠心病的發(fā)病率增加同Ⅰ型干擾素的劑量之間并無相關(guān)性。多數(shù)危險(xiǎn)因素的試驗(yàn)研究都來源某一種族，而對于其他種族是否適用并不確定。

我們在此前的研究中也得出相似結(jié)論，在冠脈造影確定的冠脈粥樣硬化程度不同的群體之間IFNα21蛋白表達(dá)并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[17]。在本文中我們進(jìn)一步研究IFNα21與亞組早發(fā)冠心病發(fā)病率之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示已知的吸煙、糖尿病、LDL-C和高血壓病史等因素早發(fā)冠心病組高于對照組數(shù)據(jù)。IFNα21蛋白濃度在早發(fā)冠心病組為（56.17±11.21）μg/L，而對照組濃度為（48.63±10.31）μg/L，通過回歸分析校正年齡、性別、LDL-C、吸煙、糖尿病史和平均血壓變量后，兩組之間進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明IFNα21蛋白的濃度與早發(fā)冠心病的發(fā)生密切相關(guān)，在今后的研究中我們將進(jìn)一步確認(rèn)IFNα21蛋白可否作為生物標(biāo)記物來優(yōu)化冠心病的風(fēng)險(xiǎn)評估及預(yù)防。

綜上所述，我們得出結(jié)論：（1）SNP rs10757278與IFNα21蛋白呈正相關(guān)；（2）干擾素α21蛋白與中國漢族人群早發(fā)冠心病的發(fā)生具有相關(guān)性。

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（收稿日期：2018-03-22）