劉忻欣

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 義烏 322000）

抗核抗體（Antinuclear antibody，ANA）是一組將自身真核細(xì)胞的細(xì)胞核成分或細(xì)胞漿中的蛋白和核酸等成分作為靶抗原的自身抗體的總稱(chēng)，是自身免疫性疾病（Autoimmune disease，AID）診斷的重要標(biāo)志物。目前我室對(duì)臨床開(kāi)放的“抗核抗體常規(guī)”套餐，包含的檢測(cè)主要包括間接免疫熒光法(Indirect ImmunoFluorescence，IIF)檢測(cè)ANA滴度與核型，免疫印跡法（Immunoblot assay，IB）檢測(cè)抗核抗體譜（ANA譜），酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）檢測(cè)雙鏈DNA（double strand DNA，dsDNA）抗體，對(duì)ELISA陽(yáng)性標(biāo)本，使用IIF進(jìn)行復(fù)檢。本文通過(guò)對(duì)ANA熒光核型與dsDNA以及其他14種抗體的對(duì)比分析，探討常見(jiàn)核型與ANA譜的關(guān)系、對(duì)比兩種抗dsDNA檢測(cè)的結(jié)果，以評(píng)價(jià)目前臨床常聯(lián)合檢測(cè)的必要性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年8月～2017年7月本院抗核抗體常規(guī)檢測(cè)標(biāo)本，使用IIF、ELISA/IIF和IB三種方法分別檢測(cè)ANA、dsDNA和ANA譜，將IIF法ANA單種熒光核型陽(yáng)性（抗體滴度≥種熒光核型）共820例作為研究對(duì)象，其中女629例，年齡16～89歲；男191例，年齡13～93歲。所有標(biāo)本均為患者靜脈血離心分離血清。

1.2 試劑和方法

1.2.1 IIF檢測(cè)ANA 采用歐盟抗核抗體IgG檢測(cè)試劑盒，以猴肝、人喉癌上皮細(xì)胞（Hep-2）生物薄片檢測(cè)血清中ANA，血清1：100稀釋后與抗原基質(zhì)于室溫下溫育反應(yīng)30 min，使用磷酸鹽緩沖液沖洗浸泡至少5 min后滴加熒光標(biāo)記的抗體IgG并避光溫育30 min，沖洗浸泡至少5 min后吸干邊緣水分，放到滴加甘油的蓋玻片上進(jìn)行封片。使用熒光顯微鏡進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.2.2 ELISA/IIF檢測(cè)抗dsDNA 均采用歐蒙相應(yīng)方法的抗雙鏈DNA抗體IgG檢測(cè)試劑盒。標(biāo)本使用ELISA進(jìn)行篩查，標(biāo)本1:201倍稀釋后加100后加到相應(yīng)微孔，同時(shí)加入陰陽(yáng)性對(duì)照及校準(zhǔn)品，室溫溫育30 min后使用稀釋后的清洗緩沖液清洗3次，加入酶結(jié)合物溫育30 min，清洗3次后加入色原/底物液避光溫育15 min，加入終止液后30 min內(nèi)450 nm比色。ELISA結(jié)果≥100 IU/ml的標(biāo)本，IIF復(fù)查，使用包被有綠蠅短膜蟲(chóng)的生物載片，樣本1:10稀釋?zhuān)瑢?shí)驗(yàn)操作同ANA檢測(cè)。

1.2.3 IB檢測(cè)ANA譜 采用歐蒙歐盟抗核抗體譜IgG檢測(cè)試劑盒，使用歐蒙印跡法自動(dòng)操作儀（EUROBlotMaster）Euro01 AAb EL30程序進(jìn)行檢測(cè)。試劑膜條用清洗緩沖液充分濕潤(rùn)，加入1.5 ml用樣本緩沖液1:100稀釋的樣本，室溫?fù)u床溫育30 min，使用清洗緩沖液清洗3次膜條，每次5 min，向溫育槽內(nèi)加入用樣本緩沖液1:1稀釋的酶結(jié)合物，室溫?fù)u床溫育30 min，使用清洗緩沖液清洗3次膜條，每次5 min，加入底物液，室溫?fù)u床溫育10 min，蒸餾水清洗膜條3次，每次1 min，將膜條放置在結(jié)果判定模板中，風(fēng)干后使用EUROLINE軟件判讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANA陽(yáng)性標(biāo)本熒光核型分析 820例ANA單項(xiàng)陽(yáng)性標(biāo)本，包括437例核顆粒型（53.29%），120例胞漿顆粒型（14.63%），106例著絲點(diǎn)型（12.93%），70例核均質(zhì)型（8.54%），48例核致密顆粒型（5.85%），25例核仁型（3.05%），7例核膜型（0.85%），4例核點(diǎn)型（0.49%），3例其他核型（包括棒環(huán)型、染色體型、分裂期細(xì)胞紡錘體陽(yáng)性等，0.37%）。核顆粒型是最常見(jiàn)的核型，其次是胞漿顆粒型、著絲點(diǎn)型。

2.2 不同核型標(biāo)本對(duì)應(yīng)抗dsDNA或ANA譜陽(yáng)性情況 ANA陽(yáng)性不同熒光核型標(biāo)本對(duì)應(yīng)抗dsDNA或ANA譜陽(yáng)性情況，見(jiàn)表1。

表1 不同核型標(biāo)本對(duì)應(yīng)抗dsDNA或ANA譜陽(yáng)性情況Table 1 Different karyotype specimens correspond to anti-dsDNAorANAspectrum positive

2.3 ELISA抗dsDNA陽(yáng)性標(biāo)本IIF復(fù)檢陽(yáng)性 ELISA抗dsDNA檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本IIF檢測(cè)陽(yáng)性情況，見(jiàn)表2。

表2 ELISA抗dsDNA陽(yáng)性標(biāo)本IIF復(fù)檢陽(yáng)性情況Table 2 ELISAanti-dsDNApositive specimens IIF retest positive

2.4 不同核型標(biāo)本對(duì)應(yīng)抗dsDNA或ANA譜結(jié)果 ANA陽(yáng)性不同熒光核型標(biāo)本對(duì)應(yīng)抗dsDNA或ANA譜陽(yáng)性情況，見(jiàn)表3。

2.5 幾種主要熒光核型的最常見(jiàn)抗體與非該核型組相比采用χ2檢驗(yàn)，見(jiàn)表4。

3 討論

AID是一組異質(zhì)性、以機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊自身一種或多種細(xì)胞成分，最終導(dǎo)致器官和組織損傷為特征的疾病。目前AID的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一就是檢出特異或相關(guān)性的自身抗體[1]。臨床檢測(cè)ANA最為常用的方法是IIF，它檢測(cè)靈敏度高、操作方便，且能夠檢出針對(duì)胞核、胞漿、細(xì)胞骨架及細(xì)胞周期等多種成分的自身抗體，具有檢測(cè)范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，被看作是“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。我室目前采用歐蒙IIF試劑盒檢測(cè)ANA，為3.2倍滴度系統(tǒng)，臨界值為1:100（±），由于老齡人群和某些特定生理階段ANA檢測(cè)可能會(huì)顯示低滴度陽(yáng)性[3]，本次研究選取ANA滴度1:320（＋）及以上單項(xiàng)陽(yáng)性共820例樣本作為研究對(duì)象。研究結(jié)果顯示820例ANA陽(yáng)性標(biāo)本中，核顆粒型占53.29%，胞漿顆粒型占14.63%，著絲點(diǎn)型占12.93%，核均質(zhì)型占8.54%，核致密顆粒型占5.85%，核仁型占3.05%，核膜型0.85%，核點(diǎn)型占0.49%，各核型陽(yáng)性率與國(guó)內(nèi)曾有報(bào)道存在一定偏差[4]。分析原因，可能由于選取滴度標(biāo)準(zhǔn)，因時(shí)間、地域、人群差異導(dǎo)致的群體疾病譜構(gòu)成差異。同時(shí)，不同實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)程序、試劑盒、稀釋倍數(shù)及報(bào)告者的主觀(guān)影響也會(huì)對(duì)陽(yáng)性率造成影響。此外，本次研究將核致密顆粒型（DFS）納入統(tǒng)計(jì)，目前對(duì)于該核型的研究認(rèn)為其無(wú)特異性，是正常人群中最常見(jiàn)的ANA高滴度核型[5]，而當(dāng)?shù)味仍?:320以上時(shí)AID患者陽(yáng)性率高于非AID患者[6]，由于其熒光形態(tài)易與均質(zhì)型和顆粒型混淆而誤導(dǎo)臨床，故已在國(guó)際共識(shí)中被列為一級(jí)必報(bào)核型[7]，這也導(dǎo)致本研究核型統(tǒng)計(jì)差異于以往報(bào)道。820例IIF陽(yáng)性標(biāo)本中，抗體檢出陽(yáng)性率為73.9%，低于同類(lèi)文獻(xiàn)報(bào)道[4]。究其原因，除了本研究只覆蓋了抗dsDNA和14種ANA譜條帶而可能產(chǎn)生遺漏以外，還可能是對(duì)于僅檢出抗Sm弱陽(yáng)性的標(biāo)本，我室結(jié)合抗nRNP陰性通常認(rèn)為抗Sm出現(xiàn)假陽(yáng)性而修正了報(bào)告。820例ANA陽(yáng)性中，ELISA檢測(cè)抗dsDNA陽(yáng)性率為0.85%，低于文獻(xiàn)報(bào)道[4]，可能是由于實(shí)驗(yàn)方法不同引起的。實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到未被我室作為結(jié)果報(bào)告的ANA譜條帶中抗dsDNA陽(yáng)性率明顯高于ELISA，但具體數(shù)據(jù)難以統(tǒng)計(jì)。對(duì)于ELISA檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本復(fù)查IIF發(fā)現(xiàn)，核均質(zhì)型100%為IIF陽(yáng)性，而核顆粒型則33.33%IIF陽(yáng)性，總復(fù)檢陽(yáng)性率71.42%，認(rèn)為ELISA檢測(cè)抗dsDNA存在假陽(yáng)性，且在核顆粒型中更常見(jiàn)，但此次樣本數(shù)太少，若需證實(shí)還需要進(jìn)一步的研究。曾有國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道使用兩種方法聯(lián)合檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者抗dsDNA，同時(shí)存在ELISA＋I(xiàn)IF－和ELISA－IIF＋結(jié)果，且兩種方法結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。而國(guó)外學(xué)者通過(guò)隨訪(fǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抗dsDNA陽(yáng)性出現(xiàn)于ANA核均質(zhì)型的比率高于核顆粒型，且對(duì)于ANA陽(yáng)性標(biāo)本患者使用兩種以上定量方法聯(lián)合檢測(cè)抗dsDNA，其陽(yáng)性結(jié)果對(duì)SLE的診斷具有更高的特異性[9]。

表3 不同核型標(biāo)本對(duì)應(yīng)抗dsDNA或ANA譜結(jié)果Table 3 Results of anti-dsDNAorANAspectra for different karyotype specimens

表4 主要核型最常見(jiàn)抗體與非該核型組結(jié)果比較Table 4 Comparison of the Results of the most common karyotype antibodies and non-nuclear group

研究結(jié)果顯示，核顆粒型中，最常見(jiàn)抗體為抗SSARo52（55.15%）、抗 SSA（57.89%）、抗 SSB（21.05%）和 抗 nRNP（26.77%）；胞漿顆粒型中，最常見(jiàn)抗體為抗AMA M2（30%）；著絲點(diǎn)型中，最常見(jiàn)抗體為抗CENP B（98.11）；核均質(zhì)型中，最常見(jiàn)抗體為抗核小體（32.86%）和抗組蛋白（21.43%）。以上與非該核型組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），特別是抗CENP B對(duì)著絲點(diǎn)型具有很高特異性。

本次研究證實(shí)了ANA熒光核型與ANA譜相關(guān)抗體之間的聯(lián)系，對(duì)于臨床的報(bào)告和診斷具有參考意義，但數(shù)據(jù)中也可發(fā)現(xiàn)核型與具體抗體并無(wú)絕對(duì)的相關(guān)性。并且，由于受到本室實(shí)驗(yàn)操作和人員經(jīng)驗(yàn)的限制，可能發(fā)生一定的遺漏、判讀偏差及存在低滴度混合核型的情況，所以我室設(shè)置相抗核抗體常規(guī)套餐”通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用多種實(shí)驗(yàn)方法，并同時(shí)結(jié)合ANA滴度、核型、ANA譜、臨床癥狀、體征以及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果（如血常規(guī)、血沉、特定蛋白、其他特征性抗體等），以期能夠綜合判斷，出具更符合臨床的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。而國(guó)內(nèi)外研究也在探索不同檢測(cè)方法新的組合模式或檢驗(yàn)程序，致力于支持AID的診斷[10]。