孟祥宇 張艷麗 霍忠明 牟政強(qiáng) 王化敏 閆喜武

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β-1,3-葡聚糖對(duì)副溶血弧菌感染菲律賓蛤仔()的存活及兩種免疫基因表達(dá)影響*

孟祥宇 張艷麗 霍忠明①牟政強(qiáng) 王化敏 閆喜武

(大連海洋大學(xué) 遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 大連 116023)

本文以菲律賓蛤仔()為材料，開展了不同濃度b-1,3-葡聚糖對(duì)正常菲律賓蛤仔及副溶血弧菌()感染后蛤仔的存活率和凝集素基因()、Toll樣受體2基因()的表達(dá)研究。結(jié)果顯示，b-葡聚糖浸泡蛤仔可以有效提高副溶血弧菌感染后蛤仔的存活率，在1000 mg/L濃度下，存活率最高，未感染組的鰓組織中，在6 h時(shí)達(dá)到峰值，顯著高于其他時(shí)間(<0.05)。在感染組中，呈先升高后降低的趨勢(shì)，在1.5 h時(shí)達(dá)到峰值。感染組和未感染組的表達(dá)均為先升高后下降趨勢(shì)。在3 h時(shí)，100 mg/L未感染組的相對(duì)表達(dá)量顯著高于100 mg/L感染組(<0.05)。在外套膜中，感染組和未感染組在3~12 h之間表達(dá)量逐漸降低。在24 h時(shí)，1000 mg/L未感染組表達(dá)量最高。感染組在外套膜中，濃度為1000 mg/L的實(shí)驗(yàn)組比100 mg/L實(shí)驗(yàn)組各時(shí)段都有更高的表達(dá)量，但只有0和24 h時(shí)差異顯著(<0.05)。蛤仔鰓和外套膜的表達(dá)模式不同，但b-葡聚糖的浸泡都促進(jìn)了在感染初期的表達(dá)。從結(jié)果上看，b-葡聚糖的浸泡會(huì)增加這2種基因的相對(duì)表達(dá)，被b-葡聚糖浸泡過的蛤仔被副溶血弧菌感染后，會(huì)更為快速地表達(dá)和。本研究旨在通過不同浸泡濃度b-葡聚糖對(duì)蛤仔存活及免疫基因表達(dá)的影響，初步了解b-葡聚糖對(duì)蛤仔免疫力的作用，為蛤仔親貝的保種、苗種繁育及池塘養(yǎng)殖的疾病防控提供一定的理論依據(jù)。

b-葡聚糖；菲律賓蛤；副溶血弧菌；免疫基因

菲律賓蛤仔()是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一。目前，我國(guó)蛤仔年產(chǎn)量約300萬(wàn)t, 約占世界蛤仔總產(chǎn)量的90%(張國(guó)范等, 2010)。但近年來(lái)，由于水質(zhì)環(huán)境惡化，養(yǎng)殖生產(chǎn)盲目擴(kuò)大，主要蛤仔養(yǎng)殖區(qū)病害頻發(fā)，使產(chǎn)業(yè)遭受了巨大的損失，其中弧菌屬()的病原菌是蛤仔疾病的主要致病因素(Moreira, 2012)。

副溶血弧菌()是一種嗜鹽的革蘭氏陰性菌，是弧菌屬的一個(gè)種類。副溶血弧菌是海水養(yǎng)殖動(dòng)物主要病原菌之一，蝦蟹(王小玉等, 2006; Krantz, 1969)及貝類(Bartley, 1971)等水產(chǎn)動(dòng)物都是其侵染對(duì)象。它通過與宿主細(xì)胞間相互作用產(chǎn)生致病毒素直至宿主死亡。沈亞林等(1993)報(bào)道了副溶血弧菌對(duì)健康文蛤()具有很強(qiáng)的致病性，患病文蛤足伸出、對(duì)刺激反應(yīng)遲純、外殼邊緣附有粘液、離水不久體液溢出。林強(qiáng)等(2012)研究表明，牡蠣()養(yǎng)殖中水溫和副溶血弧菌總量呈正相關(guān)，鹽度和副溶血弧菌總量呈負(fù)相關(guān)。副溶血弧菌感染菲律賓蛤仔的研究只有零星報(bào)道。僅見于菲律賓蛤仔胃蛋白酶酶解產(chǎn)物能夠抑制副溶血弧菌活性的報(bào)道(萬(wàn)慧一, 2012; 劉淇等, 2013)。

β-葡聚糖(β-1,3-glucans)是由β(1→3)糖苷鍵連接α-D-葡萄糖形成的葡萄糖聚合物，具有增強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物自身的免疫力，提高抗逆性，減少死亡率，改善生長(zhǎng)狀況和飼料利用的效率，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝等生物功能?，F(xiàn)已被廣泛認(rèn)為是一種潛力巨大的免疫促進(jìn)劑(Williams, 1991; Brown, 2003)和非特異性免疫的免疫激活劑(杜肖娜等, 2001)。目前，β-葡聚糖作為免疫促進(jìn)劑在貝類中的應(yīng)用，僅見于王晶(2007)對(duì)菲律賓蛤仔的酚氧化酶的影響的研究，在其他貝類中尚無(wú)報(bào)道。

與其他無(wú)脊椎動(dòng)物一樣，蛤仔缺乏特異性免疫系統(tǒng)，只能依賴其非特異性免疫來(lái)防御疾病。TLR2 (Toll- like receptor 2)具有識(shí)別病原體，啟動(dòng)天然免疫等功能，在抗感染過程中起到尤為重要的作用(唐深等, 2004)。TLR2信號(hào)途徑的激活，可以產(chǎn)生促凋亡蛋白(FADD，F(xiàn)as-associated death domain protein)和Caspase-8，導(dǎo)致表達(dá)TLR2的細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而可降低過度的免疫應(yīng)答，調(diào)控機(jī)體對(duì)入侵病原體的免疫應(yīng)答在適度的水平(Means, 1999)。而動(dòng)物凝集素也是無(wú)脊椎動(dòng)物抵御病原體入侵過程中的極其重要的因子，可以識(shí)別外源物質(zhì)。此外，動(dòng)物凝集素能與體液中或細(xì)胞表面的糖配體結(jié)合，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的反應(yīng)(朱月, 2005)。Wang等(2011)在對(duì)櫛孔扇貝()凝集素基因研究發(fā)現(xiàn)，其存在于扇貝TLR信號(hào)通路的免疫系統(tǒng)中，在抵御鰻弧菌()侵染過程中起著至關(guān)重要的作用。

本研究旨在通過不同浸泡濃度β-葡聚糖對(duì)蛤仔存活及免疫基因表達(dá)的影響，初步了解β-葡聚糖對(duì)蛤仔免疫力的作用，為蛤仔親貝的保種、苗種繁育及池塘養(yǎng)殖的疾病防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

本研究菲律賓蛤仔采自大連黑石礁海區(qū)的野生群體。蛤仔殼長(zhǎng)為2.5~3.5 cm，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1周，養(yǎng)殖水溫為18℃~21℃，24 h連續(xù)充氣培養(yǎng)。副溶血弧菌取自大連海洋大學(xué)水產(chǎn)病害研究室。

1.2 菌株的制備

菌株接種于NA營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上(取33 g NA培養(yǎng)基用1000 ml蒸餾水加熱溶解，于121℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min，倒板備用)，7℃時(shí)培養(yǎng)24 h，然后用滅菌海水洗下菌苔，以2000 r/min離心10 min，棄掉上清液，收集沉淀，再用滅菌海水洗3次，配成濃度為3×109cell/ml [108~109CFU/ml (CFU/ml指的是每毫升樣品中含有的細(xì)菌菌落總數(shù)；CFU/g指的是每克樣品中含有的細(xì)菌菌落總數(shù))]的菌懸液，用于活菌免疫誘導(dǎo)。

1.3 蛤仔病原菌的人工感染

共設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為副溶血弧菌感染的蛤仔實(shí)驗(yàn)組(C)、100 mg/L β-葡聚糖浸浴蛤仔實(shí)驗(yàn)組(A1)、1000 mg/L β-葡聚糖浸浴蛤仔實(shí)驗(yàn)組(A2)、100 mg/L β-葡聚糖浸浴后副溶血弧菌感染的蛤仔實(shí)驗(yàn)組(B1)、1000 mg/L β-葡聚糖浸浴后副溶血弧菌感染的蛤仔實(shí)驗(yàn)組(B2)。每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組 38個(gè)健康蛤仔。

用天平稱取200 g β-葡聚糖粉末(河北銀峰食品科技有限公司，白色粉末，化學(xué)式[C6H10O5]n)，在容量瓶中加入20 L海水和稱取好的粉末，配制成10 g/L的母液(無(wú)色透明粘稠液體)備用。向容積為30 L水槽中加入β-葡聚糖母液，配置濃度為100 mg/L(A1，B1)和1000 mg/L(A2，B2)的β-葡聚糖母液。分別向各個(gè)實(shí)驗(yàn)組放入38個(gè)健康蛤仔。β-葡聚糖浸泡1 d后，向B1、B2、C水槽中的蛤仔注射副溶血弧菌，用注射器吸取濃度為3×109CFU/ml的副溶血弧菌10 μl，從蛤仔殼后緣傾斜插入到殼頂部位，吸取到血液后連同血液和菌液一起注入血腔內(nèi)，立即放回水槽中。向A1、A2中，以同樣的方式注入PBS。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在注射副溶血弧菌后的0、1.5、3、6、12和24 h，分別對(duì)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的蛤仔取樣。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)個(gè)體的鰓組織和外套膜組織，用液氮速凍，儲(chǔ)存在–80℃冰箱中備用。將保存好的鰓和外套膜從–80℃冰箱取出，在液氮下研磨后，按照天根生化科技(北京)有限公司的動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取，再按照TaKaRa Primer ScriptTMRT Reagent Kit說(shuō)明合成cDNA。從本實(shí)驗(yàn)室菲律賓蛤仔轉(zhuǎn)錄組中選取核心序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，由大連萬(wàn)澤生物公司合成，引物。本研究采用作為內(nèi)參基因，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

將反轉(zhuǎn)錄所得的全部cDNA各取2 μl混合，做為cDNA的混合模板，按照50、51、52、53、54、55倍數(shù)梯度稀釋，制備目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線。在每個(gè)擴(kuò)增效率合格后(1.9~2.1)，使用SYBR?Premix Ex?Ⅱ(TliRNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa，大連)在LightCycler? 480定量PCR儀(Roche，上海)上對(duì)候選基因進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μl，每個(gè)樣品 3組重復(fù)，反應(yīng)體系見表2。實(shí)驗(yàn)采用兩步法PCR反應(yīng)程序，反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線反應(yīng)條件為95℃ 15 s，60℃ 1 min，60℃~95℃；50℃ 30 s。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系

Tab.2 Quantitative real-time PCR detecting system

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

24 h后統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組存活率。對(duì)于熒光定量結(jié)果的分析采用二階導(dǎo)數(shù)2–??Ct法計(jì)算2種蛤仔的免疫基因在β-葡聚糖對(duì)副溶血弧菌感染的鰓和外套膜中相對(duì)表達(dá)量的變化。2種蛤仔免疫相關(guān)基因的平均標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量均用C組表達(dá)量校準(zhǔn)。最終計(jì)算結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2–??Ct具體計(jì)算方法如下：

?t=目的基因t－內(nèi)參基因t;

??t=實(shí)驗(yàn)組△t－對(duì)照組Ct;

最后，計(jì)算2–??Ct值，得出的值就是基因的相對(duì)表達(dá)量。

結(jié)果分析比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，用SPSS20.0處理數(shù)據(jù)，差異顯著性設(shè)置為<0.05。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組存活率比較

各實(shí)驗(yàn)組蛤仔存活率見圖1。從圖1可以看出，A1、A2、B1和B2組的存活率顯著高于對(duì)照組(<0.05)，但彼此之間無(wú)顯著差異(>0.05)。

圖1 不同實(shí)驗(yàn)組的存活率

C：未經(jīng)β-葡聚糖浸泡，感染副溶血弧菌；A1：100 mg/L β-葡聚糖浸泡，未感染副溶血弧菌；A2：1000 mg/L β-葡聚糖浸泡，未感染副溶血弧菌；B1：100 mg/L β-葡聚糖浸泡，感染副溶血弧菌；B2：1000 mg/L β-葡聚糖浸泡，感染副溶血弧菌。下同。相同字母表示無(wú)顯著差異(>0.05)，不同字母表示具有顯著性差異(<0.05)

C: Without β-glucan, infected with; A1: 100 mg/L β-glucan, withoutinfection; A2: 1000 mg/L β-glucan, withoutinfection; B1: 100 mg/L β-glucan, withinfection; B2: 1000 mg/L β-glucan, withinfection. The same as below. There is no significant difference between the same letters(>0.05), and the different letters mean significant difference (<0.05)

2.2 TLR2表達(dá)

蛤仔鰓中表達(dá)情況見圖2。結(jié)果顯示，A1和A2組中，在6 h時(shí)達(dá)到峰值，顯著高于其他時(shí)間(<0.05)，其他時(shí)間段均無(wú)顯著差異(>0.05)。在B1和B2組中，呈先升高后降低的趨勢(shì)，在1.5 h時(shí)達(dá)到峰值。在6 h時(shí)，B1、B2組相對(duì)表達(dá)量顯著低于A1、A2組(<0.05)。12 h時(shí)，B1組中，相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組(<0.05)。24 h時(shí)，B1組表達(dá)量仍顯著高于A1組(<0.05)。B1組0、1.5和12 h時(shí)，基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異，但都顯著高于3 和6 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量(<0.05)。B2組在0、1.5 h時(shí)，相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他時(shí)間(24 h除外)(<0.05)。

蛤仔外套膜中表達(dá)情況見圖3。結(jié)果顯示，同一時(shí)間下，0 h時(shí)A1組相對(duì)表達(dá)量顯著低于A2組(<0.05)。所有實(shí)驗(yàn)組在3~12 h之間表達(dá)量逐漸降低，而在24 h時(shí)，A2組表達(dá)量最高。但3~ 24 h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(>0.05)。相同實(shí)驗(yàn)條件下，A2、B1、B2組的相對(duì)表達(dá)量在24 h顯著高于12 h時(shí)各組對(duì)應(yīng)的相對(duì)表達(dá)量(<0.05)。

圖2 鰓組織中TLR2的表達(dá)

同一時(shí)間，大寫字母表示組間差異顯著(<0.05)相同字母表示無(wú)顯著差異(>0.05)；同一實(shí)驗(yàn)條件下，不同小寫字母表示各組在不同時(shí)間點(diǎn)差異顯著(<0.05)，相同字母者表示差異不顯著(>0.05)。下同

In the same experimental period, different capital letters indicate significant difference (<0.05), the same letter indicate no significant difference (>0.05); In the same experimental treatment, different small letters indicate significant difference(<0.05), the same letter indicate no significant difference (>0.05). The same as below

圖3 外套膜中的表達(dá)

Fig.3 The expression ofin mantle

2.3 Lectin表達(dá)

蛤仔鰓中表達(dá)情況見圖4。結(jié)果表明，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組表達(dá)趨勢(shì)均為先升高后下降。在1.5~3 h之間表達(dá)出現(xiàn)峰值。1.5 h時(shí)，A2、B1組的相對(duì)表達(dá)量顯著高于A1組(<0.05)。3 h時(shí)，A1組的相對(duì)表達(dá)量顯著高于B1組(<0.05)。6、12 h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(>0.05)，且在6~24 h之間，各實(shí)驗(yàn)組表達(dá)模式趨于穩(wěn)定，無(wú)顯著變化(>0.05)。

蛤仔外套膜中表達(dá)情況見圖5。結(jié)果表明，相同時(shí)間下，0 h時(shí)，B2實(shí)驗(yàn)組相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。3 h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(>0.05)。12 h時(shí)，A1、A2和B1、B2組之間，相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異，但B1、B2組相對(duì)表達(dá)量顯著高于A1、A2組(<0.05)。24 h時(shí)，B2組相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(<0.05)。B2組表達(dá)量始終高于B1組，但只有0和24 h時(shí)差異顯著(<0.05)。

圖4 鰓組織中Lectin的表達(dá)

圖5 外套膜中Lectin的表達(dá)

3 討論

β-葡聚糖是一種廣泛地存在于細(xì)菌、真菌、植物內(nèi)部用于構(gòu)筑多種細(xì)胞壁的材料。β-葡聚糖有很好的應(yīng)用前景，已被廣泛認(rèn)為是一種非特異性免疫激活劑，也可促進(jìn)與補(bǔ)體相關(guān)的特異性抗體應(yīng)答。本研究結(jié)果表明，β-葡聚糖可有效提高副溶血弧菌感染的蛤仔的存活率，且浸泡1000 mg/Lβ-葡聚糖的蛤仔的存活率高于浸泡100 mg/Lβ-葡聚糖的蛤仔。目前，關(guān)于β-葡聚糖對(duì)魚類免疫作用的研究已有較多報(bào)道(劉露等, 2017; Robertsen, 1990; R?rstad, 1993; Aakre, 1994)。但β-葡聚糖在雙殼貝類的研究相對(duì)較少，Anderson等(2011)在弗吉尼亞牡蠣()中發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖能提高循環(huán)血細(xì)胞的數(shù)量用于防御反應(yīng)，促進(jìn)血細(xì)胞的免疫活性，并加強(qiáng)血液凝集。

菲律賓蛤仔為濾食性動(dòng)物，濾食水中的β-葡聚糖會(huì)產(chǎn)生一系列免疫作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在鰓中，A1和A2組的在6 h時(shí)達(dá)到峰值，顯著高于其他時(shí)間(<0.05)，在其他時(shí)間段均無(wú)顯著差異(>0.05)。在B1和B2組中，呈先升高后降低的趨勢(shì)，在1.5 h時(shí)達(dá)到峰值?？梢钥闯觯腥窘M較未感染組提前出現(xiàn)基因表達(dá)峰，說(shuō)明副溶血弧菌感染蛤仔后，蛤仔能迅速的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)LPS的感染。但相同時(shí)間下，不同β-葡聚糖浸浴濃度感染組內(nèi)(即B1和B2組)數(shù)據(jù)無(wú)明顯規(guī)律更沒有顯著差異，不同β-葡聚糖浸浴濃度的未感染組(即A1和A2組)在3~6 h時(shí)，A2組高于A1組，但差異不顯著。而外套膜中，感染組與未感染組之間基因表達(dá)量無(wú)顯著差異。目前，在露斯塔野鯪()(Samanta, 2012)、大菱鲆()(Zhang, 2016)和石斑魚()(Li, 2011a)的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，的表達(dá)在寄生蟲和細(xì)菌感染下，均出現(xiàn)顯著的升高。另外，在貝類相關(guān)的研究中，櫛孔扇貝存在一個(gè)相當(dāng)?shù)湫偷腗yD88依賴的TLR信號(hào)通路，并確定該通路在扇貝固有免疫系統(tǒng)，特別是在抵御鰻弧菌()侵染過程中起至關(guān)重要的作用，其具體機(jī)制可能包括調(diào)控抗氧化基因的表達(dá)、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及調(diào)控抗菌蛋白基因的表達(dá)(Wang, 2011)。Qiu等(2007)發(fā)現(xiàn)，櫛孔扇貝血細(xì)胞中，在1 μg/ml LPS刺激下表達(dá)量在6 h時(shí)增加了2倍，但在100 ng/ml濃度時(shí)，出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。結(jié)果表明，的表達(dá)可能受LPS的誘導(dǎo)，這種調(diào)節(jié)是劑量依賴性的。關(guān)于長(zhǎng)牡蠣()中的研究表明，定位于內(nèi)涵體中發(fā)揮作用，并且TLR通路中被Oyster Herpesvirus-1 (Oshv-1)誘導(dǎo)上調(diào)并且在一些時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照形成顯著差異(<0.05)(杜以帥, 2013)。

在本研究中，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的鰓組織中，表達(dá)趨勢(shì)均為先升高后下降。在1.5~3 h之間，表達(dá)出現(xiàn)峰值。說(shuō)明β-葡聚糖對(duì)表達(dá)有促進(jìn)作用且副溶血弧菌的感染引起了機(jī)體內(nèi)的免疫應(yīng)答。外套膜B組內(nèi)浸泡濃度1000 mg/L的實(shí)驗(yàn)組比100 mg/L組各時(shí)段都有更高的表達(dá)量，但只有0和24 h時(shí)差異顯著(<0.05)。相對(duì)表達(dá)量的增值與β-葡聚糖濃度的關(guān)系仍需要進(jìn)一步探究。在甲殼綱中，段亞飛等(2017)報(bào)道，糞腸球菌()能引起脊尾白蝦()血細(xì)胞和肝胰腺中的C型凝集素基因()表達(dá)出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。可作為脊尾白蝦感染糞腸球菌疾病的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。對(duì)于雙殼貝類，談艷苗(2013)研究發(fā)現(xiàn)，櫛孔扇貝在血細(xì)胞以及其他各組織中均有表達(dá)，但在外套膜、腎臟以及性腺中的轉(zhuǎn)錄水平最高，血細(xì)胞、鰓和肝胰腺次之，在肌肉中的轉(zhuǎn)錄水平較弱。另外，王昊(2006)研究發(fā)現(xiàn)，在革蘭氏陽(yáng)性菌溶壁微球菌()和革蘭氏陰性菌鰻弧菌刺激后，櫛孔扇貝血液中的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，并且呈明顯的隨時(shí)間變化趨勢(shì)，其結(jié)果說(shuō)明，不僅具有識(shí)別入侵微生物的功能，而且可能作為效應(yīng)因子起到直接殺滅入侵微生物的作用。其他貝類的相關(guān)研究也得到了相同的表達(dá)趨勢(shì)(吳彪等, 2013; 李猛等, 2015)，這表明，凝集素基因參與對(duì)外源生物入侵的免疫應(yīng)答，有助于提高免疫防御能力。關(guān)于菲律賓蛤仔免疫應(yīng)答方面的研究，Adhya等(2010)發(fā)現(xiàn)，各組織中在帕金蟲()和弧菌()感染后表達(dá)量均顯著上升。Li等(2011b)發(fā)現(xiàn)，鰻弧菌刺激后，菲律賓蛤仔血細(xì)胞中唾液酸結(jié)合凝集素(SABL)表達(dá)呈先下降后上升的趨勢(shì)。

本研究表明，β-葡聚糖浸浴蛤仔會(huì)增加和的相對(duì)表達(dá)量。被β-葡聚糖浸浴過的蛤仔被副溶血弧菌感染后，會(huì)快速表達(dá)和，識(shí)別異體物質(zhì)。本研究為蛤仔親貝的保種、苗種繁育及池塘養(yǎng)殖的疾病防控提供一定的理論依據(jù)。

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Effects of β-1,3-Glucan on the Survival and Expression of Two Immune Genes inInfected with

MENG Xiangyu, ZHANG Yanli, HUO Zhongming①, MU Zhengqiang, WANG Huamin, YAN Xiwu

(Dalian Ocean University; Engineering and Technology Research Center of Shellfish Breeding of Liaoning Province;Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Dalian 116023)

In this study, the effect of beta-glucan on survival rates and the mRNA expression ofandin both uninfected and infected Manila clamswere studied. The results showed that beta-glucan could effectively improve the survival rate of Manila clams infected by. The survival rate was highest at a beta-glucan concentration of 1000 mg/L. In the gill tissues of the uninfected group (A1and A2), thepeaked at 6 h, which was significantly higher than that of other times (<0.05). In the infected group,increased to a peak at 1.5 h and then decreased.expression in both the infected and the uninfected group increased first and then decreased. The relative expression ofin the A1group was significantly higher than that of the B1group at 3 h (<0.05). In the mantle, the expression ofin both infected and uninfected groups decreased gradually between 3~12 h. At 24 h, the expression of group A2was highest. However, in the infected group, the expression ofin 1000 mg/L beta-glucan was higher than at 100 mg/L in the mantle, but there was only a significant difference at 0 h and 24 h (<0.05). The expression patterns ofin the gill and in the mantle were different, but the feeding of beta-glucan promoted the expression ofduring the early stages of infection. From these results, beta-glucan soaking can increase the relative expression of the two genes, andandare expressed more quickly after infection bywhen soaked with beta-glucan. The aim of this study is to understand the dose dependent effect conferred by beta-glucan on the immune system and the survival rate of Manila clams, which might provide some theoretical basis for the stock culture, seed breeding and disease control in pond culture of Manila clams.

Beta-glucan;;;Immune gene

* 國(guó)家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-49)和國(guó)家自然科學(xué)基金(31502163)共同資助[This work was supported by National Science Modern Agro-Industry Technology Research System (CARS-49), and National Natural Science Foundation of China (31502163)]. 孟祥宇, E-mail: 1048982628@qq.com

霍忠明，E-mail: huozm@dlou.edu.cn

HUO Zhongming, E-mail: huozm@dlou.edu.cn

2017-12-20,

2018-02-27

10.19663/j.issn2095-9869.20171220001

孟祥宇, 張艷麗, 霍忠明, 牟政強(qiáng), 王化敏, 閆喜武. β-1,3-葡聚糖對(duì)副溶血弧菌感染菲律賓蛤仔()的存活及兩種免疫基因表達(dá)影響.漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(5): 106–113 Meng XY, Zhang YL, Huo ZM, Mu ZQ, Wang HM, Yan XW. Effects of β-1,3-glucan on the survival and expression of two immune genes ininfected with. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(5): 106–113

S944.4

A

2095-9869(2018)05-0106-08

(編輯 馬璀艷)