趙換軍， 丁 路， 付瀟瀟， 王慧英, 張翠萍

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院， 北京 101100； 2. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100048)

在大面積深度燒傷患者中，皮膚的附屬器官——汗腺的缺失是燒傷后面臨的重大難題。目前，汗腺再生方式主要有自體移植和干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，鑒于自體移植受供區(qū)來源的限制，通過干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為“汗腺樣”細(xì)胞，便成為十分有應(yīng)用前景的來源[1]?；诒緦?shí)驗(yàn)室的研究基礎(chǔ)，選用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)作為種子來源，探討轉(zhuǎn)分化過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制[2]。作為表觀遺傳學(xué)重要的修飾形式，DNA甲基化對(duì)干細(xì)胞分化的調(diào)控作用已得到廣泛認(rèn)知[3]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于hMSCs轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細(xì)胞過程中DNA甲基化作用的研究尚未見報(bào)道。本研究旨在探討hMSCs轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細(xì)胞過程中，DNA甲基化的改變及組蛋白去乙?；? (HDAC4)基因甲基化對(duì)于轉(zhuǎn)分化的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (HUXMA-01001) 購(gòu)自Cyagen公司；Dulbecco's改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清均購(gòu)于Gibco公司，DNA Methylation-GoldTMKit購(gòu)自Zymo公司，Quick-g DNA提取試劑盒購(gòu)自Promega公司，PCR擴(kuò)增儀 (美國(guó)Bio-Rad)，Transwell購(gòu)自美國(guó)Corning公司，誘導(dǎo)培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室自行配置。

1.2 hMSCs誘導(dǎo)分化體系的建立

將取自健康志愿者的人皮膚汗腺細(xì)胞置于Transwell六孔板的下室中，待汗腺細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)融合至70%～80%時(shí)，放入47℃環(huán)境中40 min，造成汗腺細(xì)胞熱休克模型。在下室的經(jīng)熱休克處理后的汗腺細(xì)胞及上室的hMSCs[(1～2)×105cells)]中，分別加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基(即在汗腺培養(yǎng)基中加入1 μg/ml EGF、50 ng/ml rhEDA-A1)和DMEM專用培養(yǎng)基(Gibco)，在37℃、含5%CO2、飽和濕度的環(huán)境下建立共培養(yǎng)體系培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置平行對(duì)照 (未共培養(yǎng)的hMSCs)。共培養(yǎng)10 d后，對(duì)細(xì)胞表型等進(jìn)行鑒定。

1.3 HDAC4甲基化水平變化的檢測(cè)

亞硫酸鈉修飾DNA及MSP引物設(shè)計(jì)。hMSCs共培養(yǎng)10 d后，用Quick-g DNA試劑盒分別提取對(duì)照組及共培養(yǎng)組細(xì)胞DNA，采用EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，按操作手冊(cè)進(jìn)行亞硫酸氫鈉的轉(zhuǎn)化。隨后在http://www.urogene.org/methprimer/上，設(shè)計(jì)HDAC4的MSP引物[(分別針對(duì)未甲基化(U)和甲基化(M)的引物)]，并對(duì)HDAC4基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平進(jìn)行Mass Array驗(yàn)證。MSP引物信息具體如表1。

Tab. 1 Primer information

1.4 5-aza-CdR的干預(yù)及RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hMSCs，以2×105cells/well接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞融合至約70%～80%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組加入甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮-2-脫氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine，5-aza-CdR，Sigma)，終濃度為10 μmol/L，對(duì)照組中加入等體積PBS。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用于檢測(cè)mRNA表達(dá)。以Trizol法提取兩組細(xì)胞的RNA，使用分光光度儀進(jìn)行定量與純度測(cè)定(A260nm:A280nm)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。隨后用一步法試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳，使用Bio-Rad凝膠成像儀觀察HDAC4 mRNA和CEAmRNA水平的變化。所用引物序列由上海生物工程有限公司合成，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)軟件分析

2 結(jié)果

2.1 hMSCs及轉(zhuǎn)分化后汗腺樣SGLCs細(xì)胞

在倒置相差顯微鏡下觀察共培養(yǎng)前選取的P3代hMSCs，細(xì)胞呈紡錘狀，細(xì)胞大小均一性良好(圖1A)；人外分泌汗腺細(xì)胞呈環(huán)狀單層細(xì)胞，多呈扁平、不規(guī)則的多邊形(圖1B)；經(jīng)共培養(yǎng)10 d誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)呈多樣化，出現(xiàn)近似于汗腺樣細(xì)胞的改變，由誘導(dǎo)前的長(zhǎng)梭形變?yōu)楸馄讲灰?guī)則形態(tài)，并且逐步聚集呈向心性生長(zhǎng)(圖1C)。

Fig.1The changesof morphology in the different cells (uncoulored ×100)

A: P3ofhuman mesenchymal stem cells; B: Sweat gland cells; C: Transdifferentiationcells like sweat gland cells

2.2 HDAC4基因甲基化改變的分析

分別提取細(xì)胞轉(zhuǎn)分化前后的RNA，并作瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示產(chǎn)物為單一、特異的明亮條帶，擴(kuò)增效率良好。隨后，通過MethPrimer設(shè)計(jì)HDAC4基因的MSP引物(圖2A)，并截取HDAC4基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島3個(gè)，分別為Island1(679-867)，Island2 (905-1591)和Island3 (1604-1943)，對(duì)Island2進(jìn)行取樣檢查，探針cg2463009處CpG位點(diǎn)甲基化程度為0.901，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞中HDAC4基因?qū)?yīng)位點(diǎn)甲基化程度為0.531，與誘導(dǎo)分化前hMSCs相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；探針cg14823429處CpG位點(diǎn)甲基化程度為0.687，細(xì)胞轉(zhuǎn)分化后HDAC4基因?qū)?yīng)位點(diǎn)甲基化水平降低，由誘導(dǎo)前的0.687下降到0.386，Beta-difference大于0.2，與誘導(dǎo)分化前hMSCs相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。上述結(jié)果均顯示誘導(dǎo)前細(xì)胞HDAC4基因甲基化處于高水平。

A：The primer of the histone deacetylases 4gene in MSP；B：The change of histone deacetylases 4gene in the Island2 by Mass Array

2.3 5-aza-CdR干預(yù)后HDAC4基因及CEA基因mRNA表達(dá)情況

使用5-aza-CdR(10 μmol/L)處理后，hMSCs平均甲基化水平下調(diào)，隨之HDAC4基因mRNA表達(dá)水平明顯升高，與未處理的hMSCs相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)；同時(shí)還選取了汗腺相關(guān)基因CEA，通過PCR觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-aza-CdR處理后，CEA基因表達(dá)量明顯升高，與實(shí)驗(yàn)前比較變化明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，圖3)。

Fig.3Changes of HDAC4 gene expression before and after 5-aza-CdR treatment

3 討論

DNA甲基化參與干細(xì)胞命運(yùn)的抉擇過程得到廣泛的認(rèn)可，而且干細(xì)胞分化的過程與特定因子的甲基化模式密切相關(guān)也已得到證實(shí)[4]。Berdasco等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化參與多種成體干細(xì)胞分化的調(diào)控。

組蛋白去乙?；?HDACs)主要可分為Ⅰ類，Ⅱ類和Ⅲ類。其中，Ⅱ類可進(jìn)一步分為IIa (HDAC4，HDAC5，HDAC7，HDAC9)和IIb (HDAC6，HDAC10)。與其他HDACs不同的是，HDAC4通過對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制，廣泛參與細(xì)胞分化的調(diào)控過程[6]，并通過與特定轉(zhuǎn)錄因子的作用促進(jìn)HDAC進(jìn)入細(xì)胞核參與轉(zhuǎn)錄過程[7]。本研究使用甲基化特異性PCR對(duì)HDAC4基因的甲基化水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)前hMSCs中HDAC4基因甲基化水平較高，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化后汗腺樣細(xì)胞中HDAC4基因整體甲基化水平明顯下降。用5-aza-CdR處理實(shí)驗(yàn)組hMSCs后，發(fā)現(xiàn)HDAC4基因檢測(cè)區(qū)域的平均DNA甲基化水平亦呈整體下調(diào)狀態(tài)；可能是基于5-aza-CdR有廣泛去甲基化的影響[8]。

基于此，本研究采用飛行質(zhì)譜方法對(duì)HDAC4基因關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)HDAC4基因啟動(dòng)子區(qū)域中，部分CpG位點(diǎn)處于高甲基化狀態(tài)；且隨著使用去甲基化試劑5-aza-CdR對(duì)HDAC4基因甲基化進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組HDAC4相關(guān)基因表達(dá)明顯上調(diào)[9]。與之相對(duì)應(yīng)的是，RT-PCR檢測(cè)顯示，經(jīng)5-aza-CdR處理后，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化細(xì)胞中HDAC4基因和CEA(CEA為常用的汗腺表面標(biāo)志物)基因的mRNA表達(dá)水平升高，說明在誘導(dǎo)細(xì)胞整體甲基化水平降低的過程中，可能存在因HDAC4基因甲基化下降而上調(diào)CEA表達(dá)，最終呈現(xiàn)促進(jìn)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化進(jìn)程的效果。也可能通過改變HDAC4基因的甲基化，影響誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)而影響hMSCs轉(zhuǎn)分化過程[10-11]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在hMSCs向汗腺樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程中，HDAC4基因的甲基化水平明顯降低，與此同時(shí)CEA基因表達(dá)水平有很大提高，很可能是通過CEA基因選擇性的入核轉(zhuǎn)錄促進(jìn)轉(zhuǎn)分化的進(jìn)程。HDAC4基因的甲基化水平下降后導(dǎo)致的染色體構(gòu)象的改變以及具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。在誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化過程中，伴隨著甲基化水平的改變而存在的表觀修飾的其他作用形式，比如miRNA對(duì)轉(zhuǎn)分化的影響還有待于更進(jìn)一步的研究。