孫偉銘， 張?jiān)粗蓿?溫 馨， 席雨鑫， 袁 迪， 王躍虹， 魏 璨， 徐長(zhǎng)慶， 李鴻珠

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 黑龍江 哈爾濱 150086)

近來(lái)研究證實(shí)，硫化氫 (hydrogen sulfide, H2S) 已被認(rèn)為是繼一氧化氮 (nitric oxide, NO) 和一氧化碳 (carbon monoxide, CO) 后新發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)氣體信號(hào)分子[1]。H2S代謝和功能異常與多種心血管疾病有關(guān)，主要包括缺血/再灌注 (ischemia/reperfusion, I/R) 損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭、心肌梗死等[1-4]。I/R可引起心肌細(xì)胞損傷，進(jìn)而增加氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，缺血后適應(yīng) (ischemic post-conditioning, PC) 能夠減輕I/R損傷，但在衰老心肌細(xì)胞PC卻喪失了這種保護(hù)作用[4-5]。恢復(fù)PC對(duì)衰老心肌細(xì)胞保護(hù)作用的研究已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，外源性H2S能恢復(fù)PC對(duì)老齡大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[6]，但其機(jī)制不詳。本研究以衰老的心肌細(xì)胞H9C2為研究對(duì)象，在缺氧/復(fù)氧 (hypoxia/reoxygenation, H/R) 和PC細(xì)胞模型上給予NaHS (外源性H2S的供體)，觀察外源性H2S恢復(fù)PC對(duì)衰老心肌細(xì)胞H9C2的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

硫氫化鈉 (NaHS, Sigma)，大鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物 (AGEs) ELISA檢測(cè)試劑盒、caspase-3活性檢測(cè)試劑盒、活性氧ROS檢測(cè)試劑盒、CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒、Hoechest 33342凋亡檢測(cè)試劑盒 (碧云天公司)，其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

高速低溫離心機(jī) (Beckman)，酶標(biāo)儀 (DG3022A)，倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡(Olympus)，培養(yǎng)箱MCO-17AICO2 (Sanyo)，Real-time PCR儀 (Thermo fisher)，S-1300-U凈化工作臺(tái)等。

1.3 H9C2細(xì)胞衰老模型的建立

1.3.1 H9C2細(xì)胞的培養(yǎng) 大鼠心肌細(xì)胞株H9C2購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d換液一次，待細(xì)胞長(zhǎng)到85%～90%時(shí)傳代。

1.3.2 H9C2細(xì)胞衰老模型的建立 棄去原有的培養(yǎng)液，加入含不同濃度 (0、5、10、30、50、80、100 μmol/L) H2O2的培養(yǎng)液孵育2 h后，換正常培養(yǎng)液再孵育3 d。通過(guò)檢測(cè)AGEs含量和caspase-3活性，確定細(xì)胞衰老程度。本研究選擇30 μmol/L的H2O2作為誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的濃度，并選擇第4代H9C2細(xì)胞誘導(dǎo)其衰老。

1.3.3 衰老心肌細(xì)胞H9C2的H/R和PC模型的建立 H/R模型：衰老的H9C2細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)液中孵育3 h (缺氧培養(yǎng)液為無(wú)血清、無(wú)糖培養(yǎng)基，pH=6.8；置于缺氧罐中，通入95% N2，5% CO2) ，復(fù)氧6 h處理；PC模型：方法同H/R組，區(qū)別在于缺氧結(jié)束復(fù)氧前連續(xù)進(jìn)行3次間隔5 min的復(fù)氧/再缺氧處理，隨后復(fù)氧6 h。

1.3.4 分組 衰老心肌細(xì)胞H9C2隨機(jī)分為5組，每組8個(gè)樣本 (n=8)：(1)對(duì)照組 (control)；衰老心肌細(xì)胞H9C2在正常培養(yǎng)液中孵育9 h；(2)H/R組：衰老心肌細(xì)胞H9C2在缺氧培養(yǎng)液中孵育3 h然后正常培養(yǎng)6 h；(3)H/R +NaHS組：方法同組(2)，僅在復(fù)氧6 h過(guò)程中加入100 μmol/L NaHS；(4)PC組：方法同組(2)，缺氧結(jié)束復(fù)氧前連續(xù)進(jìn)行3次間隔5 min的復(fù)氧/再缺氧處理，隨后復(fù)氧6 h；(5)PC + NaHS組：方法同(4)，僅在PC和缺氧6 h過(guò)程中加入100 μmol/L NaHS。根據(jù)查閱文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)中不同濃度 NaHS對(duì)細(xì)胞活力的影響，選擇本研究中NaHS的工作濃度。

1.4 大鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)含量的檢測(cè)

采用ELISA試劑盒檢測(cè)AGEs含量，檢測(cè)方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：取細(xì)胞上清液，1 000 g、4℃離心10 min，去除顆粒和聚合物，在96孔板中，各孔分別加入稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl、待測(cè)樣品50 μl。立即加入50 μl生物素標(biāo)記的抗體。蓋上96孔板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1 h。甩去孔內(nèi)液體，各孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，在吸水紙上拍干。重復(fù)此操作3 次。每孔加入80 μl親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min。甩去孔內(nèi)液體，各孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，在吸水紙上拍干。重復(fù)此操作3次。各孔加入底物A、B各50 μl，輕輕振蕩混勻，37℃溫育15 min，避免光照。取出酶標(biāo)板，各孔迅速加入50 μl終止液后立即在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度(A)值。繪制AGEs標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算AGEs值。

1.5 Caspase-3活性測(cè)定

采用ELISA試劑盒檢測(cè)caspase-3活性，檢測(cè)方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：每個(gè)樣品至少1×106個(gè)細(xì)胞并溶解在50 μl裂解緩沖液中，重懸沉淀，冰浴15 min，16 000×g、4℃離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，設(shè)置反應(yīng)體系時(shí)先加入40 μl檢測(cè)緩沖液，再加入50 μl上清液，適當(dāng)混勻，隨后再加入2 mmol/L Ac-DEVD-pNA 10 μl混勻，37℃孵育1～2 h，觀察顏色變化比較明顯時(shí)即可測(cè)定A405nm。

1.6 細(xì)胞活力測(cè)定

使用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力。每孔接種3×103個(gè)細(xì)胞于96孔板中。在處理24 h后，各孔立即添加10 μl CCK-8，37℃孵育2 h。使用微孔板分光光度計(jì)，在570 nm處讀板，以確定它們的吸光度。

1.7 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

采用Hoechst 33342染色液檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞按照5×104cells/ml接種于培養(yǎng)皿中，經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理后，棄去舊培養(yǎng)液并用PBS洗滌細(xì)胞，然后在含5 μg/ml Hoechst 33242的培養(yǎng)液中正常培養(yǎng)10 min，棄去染色液并用PBS洗滌2～3次，每次3～5 min，然后直接在400×熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測(cè)

DCFH-DA是一種本身無(wú)熒光，可以自由穿透細(xì)胞膜的物質(zhì)。當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞后，可被細(xì)胞內(nèi)的酶水解生成DCFH，DCFH不能自由穿過(guò)細(xì)胞膜，從而將探針裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的ROS可以將無(wú)熒光的DCFH氧化成發(fā)綠色熒光的DCF，綠色熒光的強(qiáng)弱可以反映細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。將細(xì)胞按照5×104cells/ml接種于6孔板中。各孔處理后，用PBS洗滌2次，在含10 μmol/L DCFH-DA的無(wú)血清培養(yǎng)基中37℃避光孵育30 min。置熒光顯微鏡下隨機(jī)攝片，每孔各取5個(gè)視野，綠色熒光強(qiáng)度用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.9 Real-time PCR 法檢測(cè)基因表達(dá)

引物序列如下。Bcl-2：5′-GGCATCTTCTCCTTCCAG-3′ (forward)和5′-CATCCCAGCCTCCGTTAT-3′ (reverse)，caspase-3：5′-CAGACAGTGGAACTGACGATGA-3′ (forward)和5′-AACAGAAACATGCCCCTACCCC-3′ (reverse)，caspase-9：5′-CCCGTGAAGCAAGGATTT-3′ (forward)和5′-ACTGTGGGTCTGGGAAGC-3′ (reverse)，GAPDH：5′-CTCAACTACATGGTCTACATG-3′ (forward)和5′-TGGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′ (reverse)。主要步驟為：細(xì)胞接種于6孔板，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次，加入Trizol試劑完全裂解細(xì)胞，收集裂解后的細(xì)胞液，取1 μl裂解液，氯仿抽提，異丙醇沉淀，回收總RNA，貯存于-80℃待用。紫外分光光度計(jì)A260nm/A280nm鑒定RNA純度和濃度。取約1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄條件為：42℃溫育30 min，85℃溫育5 s，4℃反應(yīng)30 min。Bcl-2、caspase-3、caspase-9和內(nèi)參GAPDH的引物用滅菌水溶解并配制成100 μmol/L的上下游引物混合液，使用濃度為10 μmol/L。Real-time PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 min，變性95℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，共擴(kuò)增循環(huán)40次，終末延伸72℃ 6 min，4℃終止。循環(huán)擴(kuò)增結(jié)束后，記錄各組Ct值，根據(jù)2-△△CT法計(jì)算各組相對(duì)mRNA含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 H2O2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞衰老

心肌細(xì)胞H9C2用不同濃度 (0～100 μmol/L) H2O2處理2 h后再培養(yǎng)3 d，測(cè)定衰老和凋亡率。發(fā)現(xiàn)30～100 μmol/L H2O2可增加AGEs (細(xì)胞衰老的標(biāo)志物) 含量，50～100 μmol/L H2O2能夠增加caspase-3活性，30 μmol/L H2O2僅增加AGEs含量而未影響caspase-3活性 (表1)。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采用30 μmol/L H2O2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞衰老。

H2O2 (μmol/L)AGEs contentCaspase-3 activity077±110.034±0.003589±13 --10105±11 --30 348±34**0.036±0.00450 521±44**0.071±0.008**80 681±68**0.080±0.006**100 819±32**0.093±0.005**

AGEs: Advanced glycosylation end products; H202: Hydrogen peroxide

**P<0.01vs0 μmol/L H2O2group

2.2 外源性H2S對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率的影響

與Control組相比，H/R組細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高；與H/R組相比，PC組上述指標(biāo)的變化不明顯，而H/R+NaHS組和PC+NaHS組細(xì)胞活力明顯升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，并且PC+NaHS的作用強(qiáng)于H/R+NaHS(表2)。

GroupCell viability(%)Apoptotic cells(%)Control100±126±1H/R28±3**74±6**H/R+NaHS48±8##50±6##PC27±973±8PC+NaHS68±11△△▲▲34±5△△▲▲

H/R: Hypoxia/reoxygenation; PC: Ischemic post-conditioning

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group;△△P<0.01vsPC group;▲▲P<0.01vsH/R+NaHS group

2.3 外源性H2S對(duì)活性氧(ROS)產(chǎn)生的影響

I/R或H/R均可增加氧化應(yīng)激，進(jìn)而使ROS生成增加。細(xì)胞內(nèi)的ROS可以將無(wú)熒光的DCFH氧化生成發(fā)綠色熒光的DCF，綠色熒光的強(qiáng)弱可以反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。與Control比較，H/R組ROS水平顯著增加；與H/R組比較，H/R+NaHS組ROS水平明顯降低，PC對(duì)ROS水平影響不顯著；與PC組比較，PC+NaHS組ROS水平明顯降低；與H/R+NaHS組比較，PC+NaHS組ROS水平進(jìn)一步降低(圖1)。

Fig.1The change of ROS levels in the aged H9C2 cells (n=4)

H/R: Hypoxia/reoxygenation; PC: Ischemic post-conditioning

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group;△△P<0.01vsPC group;▲▲P<0.01vsH/R+NaHS group

2.4 Real-time PCR檢測(cè)Caspase-3、Capase-9和Bcl-2基因的mRNA表達(dá)

與Control組相比，H/R組caspase-3、caspase-9和Bcl-2 mRNA表達(dá)增加 (P<0.01)；與H/R組和PC組比較，H/R+NaHS組和PC+NaHS組caspase-3和caspase-9 mRNA表達(dá)均明顯下降，Bcl-2 mRNA表達(dá)均明顯升高，且PC+NaHS的作用強(qiáng)于H/R+NaHS (P<0.01)，H/R和PC對(duì)上述指標(biāo)的影響相似 (圖2)。

3 討論

H2O2通過(guò)上調(diào)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞衰老，但是細(xì)胞氧化應(yīng)激過(guò)強(qiáng)會(huì)造成細(xì)胞凋亡和壞死[7]。AGEs含量增加是衰老的一個(gè)最重要標(biāo)志[8]，caspase-3活性增加是細(xì)胞凋亡重要的標(biāo)志之一[9]。研究發(fā)現(xiàn)，30～100 μmol/L H2O2呈濃度依賴性增加AGEs含量，50～100 μmol/L H2O2同樣呈濃度依賴性增加caspase-3活性，30 μmol/L H2O2僅增加AGEs含量而未影響caspase-3活性。這表明，30 μmol/L H2O2僅誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞衰老而未誘導(dǎo)其凋亡。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，采用30 μmol/LH2O2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞衰老。

Fig.2The mRNA levels of Caspase-3 (A), Caspase-9 (B) and Bcl-2 (C) in the aged H9C2 cells (n=4)

H/R: Hypoxia/reoxygenation; PC: Ischemic post-conditioning

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group;△△P<0.01vsPC group;▲▲P<0.01vsH/R+NaHS group

在心血管疾病的發(fā)生過(guò)程中，心肌I/R損傷、心力衰竭有著緊密的聯(lián)系[7]。I/R可引起心肌細(xì)胞損傷及凋亡，其機(jī)制較為復(fù)雜。目前研究表明，氧化應(yīng)激、鈣超載、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧自由基損傷、能量代謝障礙等均參與I/R損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[6,10-11]。PC對(duì)I/R損傷具有保護(hù)作用。但是，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在老齡心肌細(xì)胞，PC喪失了這種保護(hù)作用，其相關(guān)機(jī)制為老齡化在心肌細(xì)胞的亞細(xì)胞和分子水平發(fā)揮影響，主要包括其影響DNA水平的變化、基因/蛋白表達(dá)的變化和翻譯后的修飾、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等[2,10-11]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與H/R組比較，PC對(duì)細(xì)胞活力、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響不顯著，這表明本研究結(jié)果與以往報(bào)道相一致[2,10-11]。

I/R損傷造成ROS自身清除系統(tǒng)功能紊亂，從而導(dǎo)致活性氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物在體內(nèi)過(guò)量積聚造成細(xì)胞損傷[12]。ROS含量增加可造成染色質(zhì)固縮、分離并沿核膜分布，細(xì)胞質(zhì)亦發(fā)生固縮，細(xì)胞凋亡數(shù)量升高；線粒體中脫氫酶減少，細(xì)胞活性降低。本研究結(jié)果顯示：H/R和PC均增加ROS水平，H/R+NaHS 和PC + NaHS均降低ROS水平，且PC+NaHS作用強(qiáng)于H/R+NaHS，這說(shuō)明，外源性H2S恢復(fù)PC對(duì)衰老心肌細(xì)胞H9C2的保護(hù)作用與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

I/R損傷可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，造成細(xì)胞凋亡的經(jīng)典途徑包括線粒體參與的內(nèi)在凋亡途徑、死亡受體介導(dǎo)的外在凋亡途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑介導(dǎo)的凋亡途徑，其中線粒體途徑是起決定性作用的凋亡途徑[12]。細(xì)胞損傷后，細(xì)胞色素C通過(guò)線粒體通透轉(zhuǎn)換孔或者Bcl-2家族成員形成線粒體跨膜通道釋放細(xì)胞質(zhì)中，釋放的細(xì)胞色素C能夠活化caspase-9，進(jìn)而激活caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-13]?？沟蛲龅鞍譈cl-2對(duì)線粒體通透轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放和關(guān)閉起著調(diào)節(jié)作用，可防止線粒體分裂和細(xì)胞色素C的大量釋放，抑制細(xì)胞凋亡[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H/R組和PC組細(xì)胞凋亡率明顯增加，促凋亡因子 (caspase-3和caspase-9) 和抑凋亡因子Bcl-2 mRNA表達(dá)均上調(diào)；加入NaHS后，細(xì)胞凋亡率顯著降低，促凋亡因子表達(dá)減少，抑凋亡因子表達(dá)增加，且在PC的基礎(chǔ)上加入NaHS的作用優(yōu)于在H/R基礎(chǔ)上加入NaHS的作用，該結(jié)果表明，外源性H2S通過(guò)抑制線粒體凋亡途徑恢復(fù)PC對(duì)衰老心肌細(xì)胞H9C2的保護(hù)作用。H/R組抑凋亡因子Bcl-2 mRNA表達(dá)增加，這可能是由于為了抵抗促凋亡因子增加引起的反饋?zhàn)饔玫慕Y(jié)果。

綜上所述，外源性H2S恢復(fù)PC對(duì)衰老心肌細(xì)胞H9C2的保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，H2S有望為老齡缺血性心臟病的防治提供新靶點(diǎn)。