林陽(yáng)洋 潘博

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院整形七科

小耳畸形的治療是整形外科的重點(diǎn)和難點(diǎn)，在我國(guó)發(fā)病率約為3.06/10 000[1]。目前有三種耳廓重建方法:自體移植物，人造移植物和外部假體移植。然而，自體肋軟骨雕刻難度較高，且可造成胸廓畸形;而人工支架植入可有感染、移植物排斥和外露等風(fēng)險(xiǎn)。需要更好的耳廓重建方案[2]。組織工程制作耳廓軟骨植入物，可以避免上述風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)用前景廣闊。種子細(xì)胞是組織工程技術(shù)中所用到的所有細(xì)胞的總稱。如何獲得足量的耳廓軟骨種子細(xì)胞（Auricle Chondrocytes，AuCs）進(jìn)行組織工程耳再造仍有待進(jìn)一步研究。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）可以分化成軟骨細(xì)胞，作為軟骨工程種子細(xì)胞的替代來(lái)源。單獨(dú)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化軟骨細(xì)胞或MSCs需要較長(zhǎng)的時(shí)間，增加了感染的風(fēng)險(xiǎn)，分化方向難以控制，常伴有肥大，繼而鈣化，導(dǎo)致力學(xué)性能不佳。所以單一使用軟骨細(xì)胞或MSCs目前對(duì)頭頸區(qū)域的基于細(xì)胞的軟骨修復(fù)并不理想[3]。面對(duì)細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)的困境，軟骨組織工程提出了共培養(yǎng)體系。本文對(duì)共培養(yǎng)體系在軟骨再生中的應(yīng)用進(jìn)行了全面的綜述，并比較了直接共培養(yǎng)體系和間接共培養(yǎng)體系的差異，討論了其潛在的機(jī)制及新的進(jìn)展。共培養(yǎng)研究在關(guān)節(jié)軟骨（Articular Chondrocytes，ACs）等生物工程領(lǐng)域得到大量應(yīng)用，相應(yīng)的進(jìn)展給耳廓軟骨生物工程帶來(lái)很多啟發(fā)。

1 共培養(yǎng)體系

共培養(yǎng)體系即是建立類似于體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)體系，盡可能使體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境相吻合，從而使細(xì)胞間能相互溝通信息，相互支撐生長(zhǎng)增殖，在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展出了細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)。而細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)是將2種或2種以上的細(xì)胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中，由于其具有更好地反映體內(nèi)環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，所以這種方法被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代細(xì)胞研究中。傳統(tǒng)軟骨組織工程以自身軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，存在來(lái)源不足等問(wèn)題，限制了其臨床應(yīng)用。近年來(lái)，多種來(lái)源的干細(xì)胞因其較強(qiáng)多向分化潛能、易從身體不同部位大量獲取等優(yōu)點(diǎn)，成為軟骨組織工程種子細(xì)胞的新來(lái)源。基于干細(xì)胞的共培養(yǎng)體系給軟骨組織工程研究提供了新的方法。

共培養(yǎng)體系可以獲得充足的軟骨工程種子細(xì)胞數(shù)量，具有減少軟骨細(xì)胞的去分化等明顯的優(yōu)勢(shì)。然而，大多數(shù)關(guān)于共培養(yǎng)的研究是基于顆?；蛭⒘颗囵B(yǎng)的ACs，對(duì)MSCs/AuCs共培養(yǎng)和共移植軟骨形成的研究還很少。Dlk1在成年豬AuCs中強(qiáng)烈表達(dá)，表明成熟AuCs與關(guān)節(jié)軟骨中增殖/前增生性區(qū)域的ACs處于相似的狀態(tài)[4]。ACs共培養(yǎng)的研究成果可能為工程耳軟骨的臨床轉(zhuǎn)化提供有希望的策略。

組織工程再生耳至少需要1.5億個(gè)AuCs，但最初只能分離出200萬(wàn)個(gè)AuCs。盡管AuCs增殖穩(wěn)定，但在重復(fù)單層傳代過(guò)程中，軟骨細(xì)胞表型和能力迅速喪失，這是一種常見(jiàn)的去分化現(xiàn)象，很難避免。最終，去分化導(dǎo)致纖維軟骨形成，其功能遠(yuǎn)不及透明軟骨。Zhang等人利用小耳畸形耳廓軟骨細(xì)胞和牛MSCs共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，盡管小耳畸形耳廓軟骨細(xì)胞有很強(qiáng)的增殖能力，但是在3代以后的單獨(dú)重復(fù)傳代中，其成軟骨能力迅速喪失[4]。

研究如何在獲取充足的軟骨種子細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)避免或減少去分化程度對(duì)耳廓軟骨組織工程具有重要意義。關(guān)于MSCs在共培養(yǎng)介導(dǎo)的軟骨形成中的作用和機(jī)制，目前有兩種觀點(diǎn)。一個(gè)觀點(diǎn)是MSCs可由軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)并可直接轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞，通過(guò)骨髓MSC（bMSCs）標(biāo)記、transwell分離共培養(yǎng)、軟骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基等多種方法得到證實(shí)；另一個(gè)觀點(diǎn)是MSCs可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和軟骨特異性（extracellular matrix，ECM）的產(chǎn)生。因此，這兩種機(jī)制很可能是共存的，MSCs和軟骨細(xì)胞可能是相互協(xié)同的。共培養(yǎng)對(duì)軟骨形成的作用機(jī)制尚未完全闡明。為了探討細(xì)胞間在共培養(yǎng)體系中的相互作用、可行性和有效性，Jianyu Zou等[5]提出了兩種共培養(yǎng)體系，即直接共培養(yǎng)體系和間接共培養(yǎng)體系，有助于揭示共培養(yǎng)體系在軟骨再生中的機(jī)制，為共培養(yǎng)體系在軟骨組織工程中的應(yīng)用提供了理論支持。通過(guò)共培養(yǎng)策略建立基于MCs和干細(xì)胞的、成本更低、軟骨形成更穩(wěn)定的軟骨組織再生技術(shù)，可以為工程人耳軟骨組織的臨床轉(zhuǎn)化提供一種促進(jìn)策略。

2 直接共培養(yǎng)體系與軟骨再生

直接共培養(yǎng)體系是將兩種或兩種以上的細(xì)胞均勻混合，不同來(lái)源的細(xì)胞密切接觸，通過(guò)表面受體和分泌的各種細(xì)胞因子相互作用。直接共培養(yǎng)體系可以進(jìn)一步分為單層直接培養(yǎng)（細(xì)胞直接混合），以三維直接培養(yǎng)（包括支架或水凝膠共同培養(yǎng)）。與單層培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)能較好地維持軟骨細(xì)胞的自然表型[6]。近年來(lái)，利用水凝膠顆粒作為共培養(yǎng)支架成為研究熱點(diǎn)。軟骨細(xì)胞-軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，以及軟骨細(xì)胞-間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，前者研究較少，研究主要集中于軟骨細(xì)胞和MSCs的結(jié)合。

2.1 直接共培養(yǎng)體外研究

大多數(shù)ACs可以被bMSCs替代，緩解軟骨細(xì)胞分離和擴(kuò)張帶來(lái)的問(wèn)題。無(wú)論去分化處于哪個(gè)階段，在合適的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，去分化牛ACs細(xì)胞與兔bMSCs共培養(yǎng)均可產(chǎn)生軟骨形成[7]。與單一培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)的牛ACs和兔bMSCs對(duì)TGF-β3有更高的敏感性[8]。與MSCs共培養(yǎng)時(shí)，軟骨細(xì)胞表型更加穩(wěn)定，Col II、糖胺聚糖和轉(zhuǎn)錄因子Sox9增加[9]。共培養(yǎng)顯著減少了所需的軟骨細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)了MSCs的軟骨形成，減少了體外增殖過(guò)程中的去分化，避免了纖維軟骨的形成[10]。兩種細(xì)胞類型之間的密切接觸是共培養(yǎng)的先決條件，這種相互作用改善了受體MSCs的生存能力、軟骨形成、基質(zhì)形成和穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)容物從共培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞向向鄰近的MSCs轉(zhuǎn)移，而抑制胞外囊泡(EV)轉(zhuǎn)移阻礙了共培養(yǎng)的協(xié)同作用，EV可能是這些共培養(yǎng)中主要的交流方式[11]。

很多實(shí)驗(yàn)研究關(guān)注共培養(yǎng)的比例問(wèn)題。多數(shù)研究提示軟骨細(xì)胞和MSCs（1:1）效果最佳，而另一些表明1:3、3:7和1:4比例可以產(chǎn)生更高的聚集蛋白和膠原蛋白含量。Elhussein Elbadry Mahmoud甚至嘗試了多種干細(xì)胞共培養(yǎng)的方案，bMSCs和滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞sMSCs（1:1）兩種細(xì)胞混合的抗炎特性有望改善骨關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀。之后需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估共培養(yǎng)體系中最佳的sMSCs/bMSCs比例，以便在體內(nèi)和體外通過(guò)長(zhǎng)期評(píng)估來(lái)評(píng)估骨軟骨發(fā)育潛能[12]。以上體外ACs和bMSCs的共培養(yǎng)可減輕工程關(guān)節(jié)軟骨的肥大，增強(qiáng)其功能特性。在耳廓軟骨組織工程方面，u Zhang[13]等采用AuCs：bMSCs（1:3）共培養(yǎng)，結(jié)果表明MCs具有很強(qiáng)的軟骨誘導(dǎo)能力，可以促進(jìn)bMSCs在皮下環(huán)境中穩(wěn)定的異位軟骨形成?？祵嶽4]等發(fā)現(xiàn)1:1組工程軟骨彈力蛋白密度最大，楊氏模量最高。Ki67和Dlk1的表達(dá)增強(qiáng)，顯示工程軟骨較好的增殖和成軟骨潛能。Dlk1是Notch/Delta/Serrata家族的跨膜蛋白，被認(rèn)為是軟骨祖細(xì)胞的標(biāo)記物，在小鼠肢體軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中由增生性向增生性前軟骨細(xì)胞過(guò)渡的細(xì)胞中特異性表達(dá)。Dlk1在成年豬耳軟骨細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，表明成熟耳軟骨中的軟骨細(xì)胞與關(guān)節(jié)軟骨中增殖/前增生性區(qū)域的軟骨細(xì)胞處于相似的狀態(tài)。LMieke M.Pleumeekers等[3]將牛AuCs和人bMSCs（1:4）包覆在海藻酸水凝膠中，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的軟骨基質(zhì)成分與100%牛軟骨細(xì)胞對(duì)照組相當(dāng)。然而該共培養(yǎng)體系非常脆弱，外植體未顯示軟骨樣外觀，這對(duì)其結(jié)果的持久性產(chǎn)生了疑問(wèn)[3]。相比之下，Kerry A Morrison等[14]在I型膠原蛋白水凝上共培養(yǎng)牛AuCs和牛bMSCs（1:1），發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的彈性軟骨甚至比100%AuCs培養(yǎng)物更強(qiáng)健，表明MSCs的存在引發(fā)了耳廓軟骨合成。在AuCs和bMSCs共培養(yǎng)的研究中，1:1的比例較為多見(jiàn)，且均顯示良好的結(jié)果，因此從現(xiàn)有證據(jù)看，1:1的比例較為適宜AuCs和bMSCs的共培養(yǎng)研究。

除骨髓外，脂肪MSC（ADSCs）和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng),可定向分化為軟骨細(xì)胞。ADSCs與ACs以不同比例直接共培養(yǎng)于膠原／透明質(zhì)酸構(gòu)成的3D支架中35天，1:3共培養(yǎng)組人ADSCs的Sox9、糖胺多糖含量最高，Ⅹ型膠原表達(dá)量最低。耳軟骨也可采用ADSCs進(jìn)行共培養(yǎng)，且以3:7的比例相對(duì)多見(jiàn)[15,16]。有一篇報(bào)道[17]嘗試1:5和1:10的比例直接共培養(yǎng)AuCs和ADSCs，也可以得到軟骨組織，但是觀察時(shí)間較短，構(gòu)建物數(shù)量較少，分子機(jī)制有待進(jìn)一步揭示。

有研究嘗試臍血或臍帶來(lái)源的MSCs（umbilical cord mesenchymal stem cells，uMSCs）與 ACs共培養(yǎng)。uMSCs：MSCs（1:1和1:3組）細(xì)胞支架復(fù)合體總蛋白量高于其他組[17]。將uMSCs和人ACs（5:1）直接共培養(yǎng)，可明顯促進(jìn)人uMSCs向軟骨樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并有效抑制細(xì)胞纖維化，縮減軟骨細(xì)胞用量[19]。1:1的比例下，即使低密度共培養(yǎng)（比其他共培養(yǎng)研究低約400倍），依然有充足的軟骨產(chǎn)生和良好的再分化效果。然而，也有uMSCs與ACs共培養(yǎng)成軟骨能力較差的報(bào)道[20]。未來(lái)的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步研究uMSCs分泌的特異性細(xì)胞因子及其信號(hào)通路。uMSCs來(lái)源的研究展示出良好的抗炎和抗去分化的特點(diǎn)，大多數(shù)uMSCs共培養(yǎng)中的成軟骨能力優(yōu)于bMSCs，且所需軟骨細(xì)胞比例小于bMSCs和ADSCs共培養(yǎng)，可以考慮uMSCs在耳廓工程中嘗試應(yīng)用。

2.2 直接共培養(yǎng)動(dòng)物體內(nèi)研究

隨著體外研究取得進(jìn)展，出現(xiàn)了越來(lái)越多的動(dòng)物體內(nèi)共培養(yǎng)構(gòu)建的嘗試。兔MSCs及軟骨細(xì)胞（3:1）混合接種于PGA(聚羥基乙酸)支架共培養(yǎng)并種植在成兔皮下,體內(nèi)培養(yǎng)8wk發(fā)現(xiàn)新生軟骨外觀及組織學(xué)特征良好。研究者認(rèn)為軟骨微環(huán)境在MSCs成軟骨分化及體內(nèi)軟骨形成中具有重要作用,軟骨細(xì)胞能有效地誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化并促進(jìn)MSCs體內(nèi)軟骨形成[21]。Zhou等[22]建立了體內(nèi)軟骨形成生態(tài)位，以控制外源性MSCs的分化方向。他們證實(shí)豬ACs分泌多種可溶性因子，并形成軟骨生態(tài)位，誘導(dǎo)bMSCs穩(wěn)定的成軟骨。該共培養(yǎng)體系有望修復(fù)鼻、耳等缺乏軟骨形成生態(tài)位的皮下軟骨組織損傷。在大鼠[23]和兔子[24]的軟骨缺損中，靜電紡絲PCL[23]和光交聯(lián)PCL-peg-PCL[24]等支架共培養(yǎng)體系具有很大的軟骨再生潛力。Elbadry Mahmoud等[12]建立股骨內(nèi)側(cè)髁骨軟骨模型，發(fā)現(xiàn)sMSCs/bMSCs多種干細(xì)胞共培養(yǎng)的模式能更好的填充骨軟骨缺陷，表面更加光整。

耳再造方面，Li等建立了軟骨細(xì)胞板來(lái)包裹骨髓基質(zhì)細(xì)胞工程軟骨，將其植入裸鼠皮下[25]。該方法為維持軟骨表型提供了一種成軟骨環(huán)境。值得注意的是，小耳畸形軟骨細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力和軟骨誘導(dǎo)能力，為共培養(yǎng)MSCs創(chuàng)造了一個(gè)良好的軟骨形成生態(tài)位[13]。盡管有體內(nèi)AuCs和ADSCs（1:10）共培養(yǎng)的報(bào)道[17]，但是該研究所產(chǎn)生軟骨成分（纖維軟骨還是彈力軟骨）不清，其分子機(jī)制也未得到揭示，且體內(nèi)觀察時(shí)間較短（4周）。與之相比，Mieke M.Pleumeekers將AuCs和bMSCs在裸鼠體內(nèi)皮下植入8周，首次成功構(gòu)建了基于干細(xì)胞來(lái)源的人耳工程軟骨組織[3]。然而，該皮下埋植后的軟骨彈性模量約為人耳或鼻軟骨的1%，未來(lái)可能需要機(jī)械結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的支架輔助；且細(xì)胞數(shù)量和密度與臨床所需尚存在明顯差距[3]。這些來(lái)自體內(nèi)研究的進(jìn)展為今后臨床前或臨床試驗(yàn)提供了充分的理論基礎(chǔ)。未來(lái)的研究在降低耳廓軟骨來(lái)源細(xì)胞比例的同時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)共培養(yǎng)工程軟骨組織的機(jī)械特性。靜電紡絲PCL[23]和光交聯(lián)PCL-peg-PCL[24]等體系在構(gòu)建耳廓軟骨膜，分隔軟骨核心和外被皮膚方面具有廣闊的發(fā)展前景。對(duì)耳廓軟骨共培養(yǎng)體內(nèi)研究的機(jī)制不充分，關(guān)節(jié)軟骨中常用的間接共培養(yǎng)系統(tǒng)[26,27]可能是揭示耳廓軟骨共培養(yǎng)分子機(jī)制的有力策略。

3 間接共培養(yǎng)體系與軟骨再生

間接共培養(yǎng)體系使用半透膜在物理空間中把不同的共培養(yǎng)細(xì)胞分隔開(kāi)來(lái)，使得細(xì)胞可以通過(guò)釋放各自的可溶性因子進(jìn)行交流。可溶性因子對(duì)細(xì)胞功能有顯著影響，特別是對(duì)MSCs等具有較高可塑性的細(xì)胞類型。此外，間接共培養(yǎng)具有一定的優(yōu)勢(shì)，能夠從形態(tài)上清晰的觀察MSCs與軟骨細(xì)胞在共培養(yǎng)中各自的大體形態(tài)及相應(yīng)的ECM分泌變化，且有研究表明間接共培養(yǎng)體系可比直接共培養(yǎng)表達(dá)更多的蛋白多糖及膠原物質(zhì)[28]。間接共培養(yǎng)體系也分為單層方式和三維方式。旁分泌等營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)的具體誘導(dǎo)作用機(jī)制，可以使用間接共培養(yǎng)的方式進(jìn)一步研究。

3.1 間接共培養(yǎng)體系中MSCs對(duì)軟骨細(xì)胞的作用

在共培養(yǎng)體系中，軟骨細(xì)胞的增殖或者再分化是由MSCs分泌的營(yíng)養(yǎng)因子刺激的，而ECM主要來(lái)自于軟骨細(xì)胞而不是軟骨性MSCs。MSCs具有營(yíng)養(yǎng)、抗炎和免疫抑制作用，通過(guò)調(diào)節(jié)T和B細(xì)胞誘導(dǎo)抗炎癥因子的表達(dá)，如白細(xì)胞介素10(IL-10)、IL-1受體拮抗劑(IL-1 RA)或前列腺素E2(PGE2)。間接共培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞(DPSCs)和人ACs，DPSCs通過(guò)STAT1途徑抑制金屬蛋白酶3（MMP3）和MMP13的表達(dá)，證實(shí)局部注射DPSCs可能對(duì)進(jìn)行性顳下頜關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎的治療作用[29]。ADSCs可通過(guò)誘導(dǎo)滑膜分泌具有軟骨保護(hù)作用的液體因子(如軟骨細(xì)胞增殖和軟骨基質(zhì)保護(hù))來(lái)抑制軟骨退變的進(jìn)展[30]。Karperien等的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，不同來(lái)源的MSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，MSCs展示出相似的營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)效果，提示共培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)條件和MSCs的來(lái)源依賴性不高，有一定的獨(dú)立性[28]。然而，Acharya等[31]的研究表明，人ACs或鼻中隔軟骨細(xì)胞與人bMSCs或ADSCs在共培養(yǎng)體系中具有協(xié)同作用。盡管大多數(shù)MSCs已經(jīng)凋亡，MSCs在不去分化的情況下促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，而剩余的由軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)的MSCs則表現(xiàn)出較強(qiáng)的成軟骨能力。在間接共培養(yǎng)體系中，MSCs還通過(guò)旁分泌信號(hào)抑制軟骨細(xì)胞分化[32]。Zhihua Han等[26]在間接共培養(yǎng)體系中，結(jié)合微陣列分析和生物信息學(xué)技術(shù)，首次全面鑒定了與ASCs共培養(yǎng)改變的退化性髓核軟骨細(xì)胞的差異表達(dá)lncRNA和mRNA，揭示了基因表達(dá)調(diào)控模式。目前，尚未見(jiàn)耳廓軟骨細(xì)胞間接共培養(yǎng)的研究，上述共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)提示共培養(yǎng)存在一定的依賴細(xì)胞來(lái)源的可能，但是還有爭(zhēng)議。通過(guò)間接共培養(yǎng)研究與耳廓軟骨細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的MSCs，以及借鑒生物信息學(xué)技術(shù)等深入挖掘其特殊的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)機(jī)制和基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，值得進(jìn)一步探討。

3.2 間接共培養(yǎng)體系中軟骨細(xì)胞對(duì)MSCs的作用

大多數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示間接共培養(yǎng)中軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化。在有軟骨細(xì)胞的Transwell系統(tǒng)中培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞表達(dá)II型膠原，GAG產(chǎn)生增加[33]。軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)因子可以誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基（CCM）中的bMSCs成軟骨分化，效果甚至高于TGF-β3 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基[34]。Qi Zhang等[35]體外建立Transwell體系接種ADSCs和軟骨細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)ADSCs和軟骨細(xì)胞在共培養(yǎng)組中比在單培養(yǎng)組中遷移更少，而遷移距離是判斷細(xì)胞去分化程度的重要指標(biāo)之一[20]。共培養(yǎng)組中絲狀偽足的減弱抑制了遷移，下調(diào)的MMP-2降低了ECM重塑，上調(diào)的Vinculin抑制細(xì)胞遷移。Notch信號(hào)通路可能參與了這一過(guò)程。

然而，軟骨細(xì)胞來(lái)源的因子并不總是促進(jìn)軟骨形成或者維持表型。常氧條件下鼻軟骨細(xì)胞可產(chǎn)生炎性因子，彌散通過(guò)Transwell誘導(dǎo)肥大軟骨形成，MMP13升高，降低GAG基質(zhì)和ACAN基因表達(dá)，降低共培養(yǎng)工程軟骨的成軟骨潛能。該實(shí)驗(yàn)從一個(gè)側(cè)面反應(yīng)出共培養(yǎng)體系和其它調(diào)節(jié)因素聯(lián)合的重要作用。低氧是促進(jìn)軟骨分化的常規(guī)條件之一，在常氧等不合適條件下，即使共培養(yǎng)也不足以改變軟骨細(xì)胞去分化的趨勢(shì)。

4 共培養(yǎng)體系和其它轉(zhuǎn)化因素的綜合應(yīng)用

有研究嘗試在共培養(yǎng)體系與其他條件同時(shí)作用，進(jìn)一步促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化。將KGN加入到Col-Tgel水凝膠中可為BMSCs和/或ACs的軟骨再生提供適宜的微環(huán)境[36]。對(duì)共培養(yǎng)的bMSCs和ACs進(jìn)行周期性正弦動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激，既提高了軟骨細(xì)胞的增殖能力，又改善了共培養(yǎng)細(xì)胞的軟骨表型[37]。TGF-β家族BMP-SMAD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵事件之一。Chen,M.J.等[38]建立數(shù)學(xué)模型描述共培養(yǎng)中TGF-β的作用，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性TGF-β作用下，如果軟骨細(xì)胞的初始比例超過(guò)一個(gè)臨界值，就會(huì)誘導(dǎo)完全軟骨形成；外源性TGF-β作用下，則存在一個(gè)關(guān)鍵濃度點(diǎn)，是誘導(dǎo)MSCs完全軟骨形成的必要條件。

5 結(jié)論與啟示

耳軟骨工程種子細(xì)胞的數(shù)量有限和去分化等問(wèn)題，限制了生物工程技術(shù)在耳廓軟骨再造的進(jìn)一步發(fā)展。共培養(yǎng)體系有助于解決單一培養(yǎng)在軟骨組織工程中遇到的諸多問(wèn)題。然而，潛在的機(jī)制仍然不清楚。共培養(yǎng)研究大部分都是關(guān)于干細(xì)胞與ACs的共培養(yǎng)，耳軟骨細(xì)胞的共培養(yǎng)研究較少。此外，干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞常常在直接共培養(yǎng)環(huán)境中混合在一起，從而混淆了兩種不同細(xì)胞群間基質(zhì)形成的貢獻(xiàn)。耳廓軟骨共培養(yǎng)分子機(jī)制可以借鑒關(guān)節(jié)軟骨中常用的間接共培養(yǎng)系統(tǒng)，以及基因微陣列和生物信息學(xué)等方法得到揭示。1:1的MSCs、3:7的ADSCs與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的比例相對(duì)多見(jiàn)，但是對(duì)于殘耳來(lái)源的組織工程耳，可能軟骨種子細(xì)胞來(lái)源仍然有限，部分無(wú)耳畸形的患兒甚至可能考慮從健側(cè)獲取種子細(xì)胞，進(jìn)一步限制了軟骨工程細(xì)胞的可用數(shù)量，因此需要進(jìn)一步降低共培養(yǎng)中AuCs的比例。成軟骨能力更強(qiáng)且所需軟骨細(xì)胞比例更少的uMSCs可能是一種新的選擇，兩種以上的干細(xì)胞共培養(yǎng)的方案[11]也值得嘗試。共培養(yǎng)系統(tǒng)與其它條件的綜合使用也是軟骨工程的發(fā)展方向之一。Chen,M.J.[38]等的模型建立不但揭示了TGF-β家族在軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)中的數(shù)學(xué)關(guān)系，也有望揭示軟骨細(xì)胞和各種MSCs的比例問(wèn)題，進(jìn)一步運(yùn)用在軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)技術(shù)中。期待在耳廓軟骨組織工程研究中進(jìn)一步探索共培養(yǎng)與其它因素的綜合應(yīng)用。