宛 欣， 王 茜， 李凡璐， 吳亞俐， 劉 鑫， 陳還珍， 楊 靜， 崔香麗△

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理系, 2. 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心血管內(nèi)科， 3. 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科， 太原 030001)

糖尿病 (diabetes mellitus, DM) 是由于胰島素分泌不足和/或作用缺陷引起的以高血糖為主的代謝性疾病，也是導(dǎo)致終末期腎病 (end stage renal disease, ESRD) 的常見原因。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)在糖尿病腎臟損傷的病理生理過程中起著重要作用。高濃度葡萄糖、炎癥、缺氧、氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和腎臟細(xì)胞凋亡，隨后導(dǎo)致腎臟損傷[1]。炎癥反應(yīng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激聯(lián)系密切，共同促進(jìn)糖尿病腎臟損傷的進(jìn)程。

辛伐他汀(simvastatin)為3-羥甲基戊二酸單酰輔酶A (3-hydroxy-3-methyl glutarylcoenzyme A, HMG-CoA)還原酶的抑制劑，在臨床上用于降低總膽固醇(total cholesterol, TC)的合成和低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)的水平，此外還具有抗炎、抗氧化和保護(hù)血管內(nèi)皮的作用[2-3]，現(xiàn)已作為治療動脈粥樣硬化的常規(guī)藥物。在治療心血管疾病的過程中發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀對糖尿病低血糖引起的心肌損傷有一定的保護(hù)作用，這種作用與抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)[4]。本課題前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，辛伐他汀對糖尿病引起的心臟功能損傷的保護(hù)作用與NF-κB信號通路有關(guān)[5]。本研究擬通過建立糖尿病大鼠模型，觀察辛伐他汀對糖尿病大鼠的腎臟損傷有無保護(hù)作用，并檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose regulated protein 78, GRP78)、磷酸化肌醇需求激酶1α (phosphorylated inositol-requiring enzyme 1α, p-IRE1α)，炎癥核心蛋白核因子-Kappa B p65 (nuclear factor-kappa B p65, NF-κB p65)，以及炎癥因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)的表達(dá)水平，以探討辛伐他汀保護(hù)糖尿病腎臟的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

SPF級雄性Sprague-Dawley (SD) 大鼠，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK-(軍)2012-0004。鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ, Sigma)，辛伐他汀(杭州默沙東制藥公司)，無醇蘇木素染液(Jiancheng Biotech)，伊紅染液(Jiancheng Biotech)，GRP78兔多克隆抗體(Abcam)，p-IRE1α兔多克隆抗體(Abcam)，NF-κB p65兔單克隆抗體 (Cell Signaling)，MCP-1兔多克隆抗體 (Abcam)，β-actin鼠單克隆抗體 (Proteintech)，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG (Transgen-Biotech)，羊抗小鼠IgG(Cell Signaling)，免疫組化試劑盒SABC即用型(武漢博士德)，天青石藍(lán)B(Solarbio)，天狼星紅染液(Solarbio)，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物)。

1.2 動物模型制備

24只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照(NC，n=8)組和糖尿病造模(n=16)組。糖尿病造模組大鼠采用55 mg/kg STZ(溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，pH4.5)單次腹腔注射，建立糖尿病大鼠模型；NC組大鼠腹腔注射相同劑量的檸檬酸緩沖液。72 h后從大鼠尾靜脈采血測血糖，連續(xù)三天，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L(300 mg/dl)即表示糖尿病造模成功。糖尿病造模組大鼠隨機(jī)分為糖尿病(DM)組和糖尿病+辛伐他汀(DM+Sim)組。DM+Sim組給予辛伐他汀生理鹽水混懸液40 mg/kg灌胃，1次/日，連續(xù)4周；其余兩組給予等體積生理鹽水灌胃，1次/日，連續(xù)4周。4周后殺死大鼠，快速取出雙側(cè)腎臟，使用(4～6)℃生理鹽水沖洗，部分腎組織置于10%福爾馬林液中固定，其余腎組織立即置-80℃超低溫冰箱中保存待用。

1.3 HE染色

腎組織石蠟包埋后切5 μm片，依次將切片置于蘇木素和伊紅染液中染色，氨水返藍(lán)，脫水透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)改變。

1.4 天狼星紅染色

腎組織石蠟包埋后切5 μm片，依次將切片置入天青石藍(lán)染液和苦味酸天狼星紅染液中染色，鹽酸酒精分化。脫水透明，中性樹膠封片。每張片子隨機(jī)取5個視野拍照，依據(jù)image Pro plus軟件分析統(tǒng)計(jì)紅色膠原區(qū)域面積的比值。

1.5 Western blot檢測GRP78、p-IRE1α和NF-κB p65的表達(dá)

取腎皮質(zhì)組織約50 mg，用RIPA裂解緩沖液裂解蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)總濃度。取含總蛋白50 μg的腎皮質(zhì)組織勻漿液10 μl，SDS-PAGE后半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉(0.25 g脫脂奶粉+ 5 ml TBST)封閉1.5 h，洗膜后分別加入羊抗兔GRP78多克隆抗體(1∶1 000)、羊抗兔p-IRE1α多克隆抗體(1∶1 000)，羊抗兔NF-κB p65單克隆抗體(1∶1 000)、羊抗小鼠β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4℃過夜后加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶2 000)或羊抗小鼠IgG(1∶ 2 000)，37℃孵育1.5 h；ECL顯色，Bio-Rad Image Lab凝膠成像系統(tǒng)顯影，并對Western blot條帶進(jìn)行定量分析，確定雜交條帶的吸光度值。

1.6 免疫組織化學(xué)

腎臟組織石蠟包埋后切5 μm片，常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鈉熱修復(fù)抗原，3%H2O2約50 μl消除內(nèi)源性過氧化物酶。5%BSA封閉。一抗為羊抗兔NF-κB p65單克隆抗體(1∶800)和羊抗兔MCP-1多克隆抗體(1∶100)，二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，以PBS替代一抗作為陰性對照，DAB顯微鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染。按著色范圍和著色強(qiáng)度計(jì)數(shù)結(jié)果的乘積作為評分結(jié)果[6]。

1.7 原位末端轉(zhuǎn)移酶 (TUNEL)法檢測腎臟細(xì)胞凋亡

腎臟組織石蠟切5 μm片，常規(guī)脫蠟至水，ProteinaseK工作液37℃消化，3%H2O2約50 μl消除內(nèi)源性過氧化物酶，TDT酶反應(yīng)液避光孵育，Streptavidin-HRP工作液避光反應(yīng)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。凋亡細(xì)胞核呈棕褐色顆粒，每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野(×400)，計(jì)算該視野中陽性細(xì)胞所占的百分比。光鏡下觀察并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù) (apoptosis index, AI) =視野中腎臟陽性細(xì)胞數(shù)/視野中腎臟細(xì)胞總數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎臟組織病理學(xué)變化

HE染色切片置100倍光學(xué)顯微鏡下觀察，與NC組比較，DM組可見大量的腎小球硬化，部分腎小球變形、萎縮，結(jié)構(gòu)不清，腎小管間質(zhì)可見明顯的炎細(xì)胞浸潤以及纖維化；置400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，可見DM組腎小球明顯硬化、固縮，血管腔和腎小球囊腔明顯狹窄，甚至閉塞，系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)明顯增多，說明DM組大鼠腎臟組織明顯損傷，糖尿病腎病造模成功；而DM+Sim組腎組織結(jié)構(gòu)較DM組明顯改善，NC組大鼠腎臟無明顯病理學(xué)改變(圖1，見彩圖頁Ⅰ)。

2.2 天狼星紅染色觀察腎臟組織間質(zhì)纖維化

在普通顯微鏡下，NC組腎小球以及腎小管紅色的膠原纖維呈均勻分布，著色淺；DM組大鼠腎小球以及腎小管膠原纖維紅染明顯廣泛，著色深，纏繞混亂，呈不均勻分布(P<0.01)；與DM組比較，DM+Sim組較紅染明顯減輕(P<0.01)，說明糖尿病大鼠腎臟發(fā)生了明顯的炎癥纖維化，辛伐他汀能減輕糖尿病腎臟的間質(zhì)纖維化(圖2，見彩圖頁Ⅰ)。

2.3 Western blot檢測GRP78、 p-IRE1α以及NF-κB p65蛋白質(zhì)的表達(dá)

與NC組相比，DM組大鼠腎臟的GRP78、p-IRE1α以及NF-κB p65蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著升高 (P<0.05)。而給予辛伐他汀后，大鼠GRP78、p-IRE1α以及NF-κB p65蛋白質(zhì)表達(dá)均比DM組降低(P<0.05，圖3)。提示辛伐他汀對糖尿病腎臟的保護(hù)作用可能與降低GRP78、p-IRE1α和NF-κB p65的表達(dá)有關(guān)。

Fig.3Expression of GRP78, p-IRE1α and NF-κB p65 in rat kidneys

**P<0.01vsNC group;#P<0.05vsDM group

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測腎臟中NF-κB p65、MCP-1蛋白質(zhì)的表達(dá)

NC組大鼠腎小球以及腎小管間質(zhì)有極少量NF-κB p65表達(dá)；DM組大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞以及腎小管上皮細(xì)胞核明顯呈棕黃色，即NF-κB p65呈強(qiáng)陽性表達(dá)(P<0.01)；糖尿病大鼠給予辛伐他汀后，較DM組細(xì)胞核棕黃色染色明顯減少(P<0.05)。MCP-1表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，NC組腎小球系膜區(qū)和腎小管間質(zhì)MCP-1表達(dá)極少，而DM組大鼠腎小球系膜區(qū)和腎小管間質(zhì)著色廣泛、濃集，內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞，尤以腎小管上皮細(xì)胞MCP-1表達(dá)呈強(qiáng)陽性(P<0.01)；糖尿病大鼠給予辛伐他汀后，MCP-1表達(dá)明顯下降，其著色部位與糖尿病組大鼠大致相同，但著色程度低于DM組(P<0.01，圖4)。

Fig.4NF-κB p65 and MCP-1 expression in rat kidney detected by immunohistochemistry

**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group

2.5 TUNEL法定位檢測腎組織細(xì)胞凋亡

腎臟細(xì)胞凋亡的原位檢測結(jié)果顯示，正常細(xì)胞核呈藍(lán)紫色；凋亡的細(xì)胞核呈棕褐色顆粒樣，部分凋亡的細(xì)胞核固縮變形，體積偏小。NC組僅見少量凋亡的細(xì)胞核，而DM組腎小球內(nèi)及腎小管見有大量顆粒樣的的凋亡細(xì)胞核，明顯高于對照組(P<0.01)；給予辛伐他汀后，大鼠腎臟凋亡細(xì)胞核較DM組明顯減少(P<0.01，圖5)。

Fig.5TUNELresults of apoptosis in glomerular and renal tubular cell in rats

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDM group

3 討論

糖尿病所致腎臟損傷是糖尿病微血管病變的主要并發(fā)癥之一。本實(shí)驗(yàn)采用鏈脲佐菌素制造糖尿病大鼠模型觀察糖尿病造成的腎損傷，HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎小球明顯萎縮、變形，系膜細(xì)胞明顯增多；同時(shí)天狼星紅染色也觀察到糖尿病大鼠腎小球及腎小管膠原纖維明顯紅染，纏繞混亂呈結(jié)節(jié)狀。高血糖可促進(jìn)腎小球高灌注和高濾過，刺激鈉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2(SGLT-2)的表達(dá)，鈉和葡萄糖的重吸收增加激活了腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosteronesystem, RAAS)以及促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，過多的成纖維細(xì)胞滲入間質(zhì)，導(dǎo)致間質(zhì)纖維化[7]。此外高糖環(huán)境還可損傷腎臟固有細(xì)胞，細(xì)胞損傷后誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的進(jìn)行性間質(zhì)內(nèi)流，同時(shí)激活成纖維細(xì)胞分泌膠原纖維，積累在損傷部位，導(dǎo)致炎癥纖維化的產(chǎn)生[8]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠給予辛伐他汀治療后，病理學(xué)形態(tài)改善明顯，同時(shí)膠原纖維明顯減少，證實(shí)辛伐他汀能夠保護(hù)糖尿病大鼠腎臟、減輕纖維化。

炎癥核心因子NF-κB p65和MCP-1在糖尿病大鼠腎臟組織中呈高表達(dá)，給予辛伐他汀后這些炎癥因子表達(dá)均降低。已有動物實(shí)驗(yàn)表明，大鼠腎小球MCP-1等表達(dá)增加會導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生[9]和腎小球硬化[10]。Saitoh等[11]發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者尿液中MCP-1水平升高，且與腎臟損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。而在糖尿病腎小管上皮細(xì)胞中，NF-κB的活性與MCP-1的表達(dá)高度相關(guān)，NF-κB的活化可以誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞聚集，并通過激活MCP-1促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化[12]。本結(jié)果也說明，炎癥反應(yīng)參與了糖尿病大鼠腎臟損傷的發(fā)生發(fā)展，辛伐他汀能通過抑制糖尿病大鼠腎臟炎癥反應(yīng)改善腎臟功能。

炎性因子以及高糖環(huán)境可以誘導(dǎo)ERS，使蛋白質(zhì)折疊受阻，啟動未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)[1]。原本與GRP78蛋白質(zhì)結(jié)合并處于失活狀態(tài)的IRE1α與GRP78解離，并磷酸化生成p-IRE1α而被激活。過強(qiáng)或過長時(shí)間的ERS最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)及凋亡[13]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)中，p-IRE1α進(jìn)一步激活I(lǐng)KK成為p-IKK，促進(jìn)IκB磷酸化后與NF-κB解離，游離的NF-κB亞基p65迅速進(jìn)入細(xì)胞核，與特異性κB序列結(jié)合，誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[14]。NF-κB的核移位可促進(jìn)MCP-1以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的表達(dá)，導(dǎo)致腎小球和腎小管間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤[15]。ERS中的UPR可以啟動炎癥反應(yīng)，而炎性因子又可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)，如此循環(huán)加劇組織損傷。本研究顯示，糖尿病大鼠腎臟組織GRP78和p-IRE1α表達(dá)均升高；辛伐他汀可抑制腎GRP78和p-IRE1α表達(dá)，表明糖尿病大鼠腎臟組織也發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。辛伐他汀可以有效抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并通過抑制IRE1α磷酸化降低了炎癥核心蛋白NF-κB的核移位，有效抑制了腎臟組織MCP-1表達(dá)，減輕了腎臟組織炎癥和纖維化，從而改善了腎臟功能。

本研究還觀察到，糖尿病大鼠腎小球和腎小管中存在大量凋亡的細(xì)胞核。而給予辛伐他汀治療后，凋亡的細(xì)胞核明顯減少，與Ishii等[16]在糖尿病大鼠腎組織中發(fā)現(xiàn)大量凋亡的近端小管細(xì)胞的結(jié)果相似。在高糖環(huán)境下，過長的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致GRP78--procaspase-12--procaspase-7復(fù)合物裂解，釋放有活性的caspase-12，介導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞凋亡[17]；此外，炎癥反應(yīng)還可通過線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生超氧化物，阻礙電子傳遞復(fù)合物Ⅲ，擾亂促凋亡和抗凋亡蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，激活線粒體依賴凋亡途徑[18]。辛伐他汀可通過抑制細(xì)胞凋亡來保護(hù)腎臟，但具體通過哪條凋亡途徑發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，糖尿病可造成大鼠腎臟損傷，發(fā)生腎小球萎縮和腎纖維化，導(dǎo)致炎性因子p-IRE1α和NF-κB表達(dá)升高、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和腎細(xì)胞凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)又加劇糖尿病腎臟的損傷。辛伐他汀通過有效抑制炎癥反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少腎臟細(xì)胞凋亡來緩解糖尿病所致的腎臟損傷，既可以降低由糖代謝異常引起的脂質(zhì)代謝紊亂，又可有效預(yù)防和治療糖尿病腎損傷，延緩病程。本實(shí)驗(yàn)為糖尿病腎臟疾病的治療以及他汀類新藥的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。