張 睿， 陳 璐， 葛俊美， 馬根山， 蔡君艷

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院， 江蘇 南京 210009)

由肥胖引起的糖尿病等并發(fā)癥，已成為世界性高發(fā)疾病，其數(shù)量也在快速增長(zhǎng)。哺乳動(dòng)物的棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)能通過(guò)增加能量消耗而增強(qiáng)代謝狀態(tài)，因此可作為治療糖尿病等代謝綜合征的靶點(diǎn)。

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種腎源多肽激素，其作用在于促進(jìn)骨髓生產(chǎn)紅細(xì)胞。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，EPO有調(diào)控葡萄糖耐受以及能量代謝的作用[1-4]，其機(jī)制尚不清楚。BAT釋放的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)，能增加肝的胰島素敏感性并降低血糖水平[5-7]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，EPO能通過(guò)肌肉、肝臟起到拮抗糖尿病的作用[8-10]。本研究以高脂飲食(high fat diet，HFD)喂養(yǎng)的小鼠為模型，腹腔注射EPO后觀察動(dòng)物模型的血糖含量、血漿胰島素含量和葡萄糖耐量水平的變化，以及BAT中含PR結(jié)構(gòu)域蛋白16(PR domain-containing 16，PRDM16)、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)的mRNA和蛋白質(zhì)水平的變化，以期為肥胖及其并發(fā)癥的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只4周齡的C57BL/6J雄性小鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，飼養(yǎng)在12 h光照/12 h黑暗環(huán)境中，溫度23℃，自由攝食飲水。所有小鼠都給予高脂飼料(HFD，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)喂養(yǎng)4周，其56.7%的能量來(lái)自于脂肪、23.1%的能量來(lái)自于碳水化合物、20%的能量來(lái)自于蛋白質(zhì)。所有HFD飼養(yǎng)小鼠隨機(jī)分為兩組(n=10)：HFD-EPO組和HFD-對(duì)照組(HFD-Con)。HFD-EPO組腹腔注射200 IU/kg的重組人EPO(Epoetin Alfa購(gòu)自日本JCR制藥公司)，HFD-Con組腹腔注射等體積生理鹽水。兩組動(dòng)物每周各注射3次，連續(xù)注射4周。4周后動(dòng)物禁食過(guò)夜，腹腔注射10%水合氯醛(0.4 ml/kg)麻醉后心臟穿刺取血，4 ℃分離血漿，-80℃保存。迅速分離兩組動(dòng)物的棕色脂肪組織，液氮速凍后置-80℃保存。

1.2 酶法檢測(cè)血漿葡萄糖水平

采用葡萄糖氧化酶法試劑盒(購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，遵循說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)血漿葡萄糖水平。

1.3 ELISA檢測(cè)血漿和肝臟FGF21水平

使用ELISA試劑盒(mouse ELISA kit，Sigma)檢測(cè)血漿及肝臟FGF21水平。所有操作均遵循說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.4 葡萄糖耐量檢測(cè)

HFD喂養(yǎng)小鼠腹腔注射EPO4周后，禁食過(guò)夜。次日腹腔注射葡萄糖(1.0 g/kg)，分別在注射前及注射后30、60、120 min取尾靜脈血，檢測(cè)血糖水平及胰島素水平。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠BAT中PRDM16和FGF21 mRNA的表達(dá)

使用RNA提取試劑分別提取BAT的總RNA(RNA trip,Trizol，均購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。實(shí)時(shí)定量PCR采用Go Taq qPCR Master Mix(Promega)，20 μl體系按照如下擴(kuò)增條件操作：95℃ 30 s、95℃ 3 s，30個(gè)循環(huán)；60℃ 30 s。PRDM16前導(dǎo)鏈5’-CAGCACGGTGAAGCCATTC，PRDM16滯后鏈3’-GGCGTGCATCCGCTTGT。FGF21前導(dǎo)鏈5’-AGATCAGGGAGGATGGAACA，F(xiàn)GF21滯后鏈3’-TCAAAGTGAGGCGATCCATA。以β-actin為內(nèi)參。使用MxProMx3000軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 Western blot法檢測(cè)BAT中PRDM16、p-STAT3/STAT3和FGF21蛋白質(zhì)水平

使用1 mmol/L RIPA組織裂解液提取BAT的總蛋白。SDS-PAGE(10%膠濃度)分離100 μg蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)膜后，用兔抗小鼠PRDM16多克隆抗體(Abcam，1∶1 000稀釋)、兔抗小鼠p-STAT3單克隆抗體(CST，1∶1 000稀釋)、兔抗小鼠STAT3單克隆抗體(CST，1∶1 000稀釋)、兔抗小鼠FGF21單克隆抗體(Abcam，1∶1 000稀釋)以及兔抗GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz，1∶5 000稀釋)孵育NC膜，4℃過(guò)夜。使用相應(yīng)來(lái)源的二抗室溫孵育NC膜1h，TBST洗滌5 min×3，顯色、曝光。使用Image J軟件分別分析PRDM16、p-STAT3/STAT3和FGF21蛋白質(zhì)條帶的灰度值，并與GAPDH的灰度值比較后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠體重、血糖和胰島素水平的比較

腹腔注射EPO 4周后，HFD-EPO組小鼠的體重為(26.76±0.96)g，明顯低于HFD-Con組小鼠體重(31.47±1.67)g(P<0.01，圖1A)。HFD-EPO組小鼠的空腹血糖為(62.79±8.09)mg/dl，明顯低于HFD-Con組小鼠的空腹血糖(91.06±9.86)mg/dl(P<0.01，圖1B)。HFD-EPO組小鼠血漿胰島素水平為(11.8±0.33)μU/ml，與HFD-Con組小鼠血漿胰島素水平(12.64±0.25) μU/ml無(wú)明顯差異(P>0.05，圖1C)。HFD-EPO組小鼠胰島素抵抗指數(shù)(index of insulin resistance，HOMA-IR)為1.56±0.16，明顯低于HFD-Con組小鼠胰島素抵抗指數(shù)2.80±0.13(P<0.01，圖1D)。與HFD-Con組比較，HFD-EPO組小鼠體重在實(shí)驗(yàn)第一周即呈現(xiàn)明顯減少(圖1A)。

Fig.1Comparison of body weight, HOMA-IR and the level of blood glucose, plasma insulin after EPO injection for 4 weeks between HFD-Con group and HFD-EPO group

A: Comparison of body weight between HFD-Con group and HFD-EPO group; B: Comparison of blood glucose levels between HFD-Con group and HFD-EPO group; C: Comparison of plasma insulin levels between HFD-Con group and HFD-EPO group; D: Comparison of HOMA-IR between HFD-Con group and HFD-EPO group; EPO: Erythropoietin; HOMA-IR: Homeostasis model assessment of insulin resistance

**P<0.01vsEPO-Con group

2.2 兩組小鼠糖耐量水平的比較

腹腔注射EPO 4周后，HFD-EPO組小鼠的血糖水平較HFD-Con組明顯降低(P<0.01，圖2A)。HFD-Con組與HFD-EPO組小鼠血漿胰島素水平無(wú)明顯差異(圖2B)。

A: Comparison of glucose tolerancebetween HFD-Con group and HFD-EPO group; B: Comparison of plasma insulinlevel between HFD-Con group and HFD-EPO group; EPO: Erythropoietin

**P<0.01vsHFD-Con group

2.3 兩組動(dòng)物棕色脂肪組織PRDM16 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的比較

腹腔注射EPO 4周后，HFD-EPO組小鼠BAT質(zhì)量為(0.150±0.010)g，明顯高于HFD-Con組小鼠(0.078±0.031) g(P<0.01，圖3A)。HFD-EPO組PRDM16 mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.288±0.063，明顯高于HFD-Con組小鼠PRDM16 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(1.903±0.049，P<0.01，圖3B)。HFD-EPO組小鼠PRDM16的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量為0.2034±0.009，明顯高于HFD-Con組小鼠PRDM16蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量(0.1510±0.008，P<0.01，圖3C)。

Fig.3Comparison of PRDM16 mRNA and PRDM16 protein expression between HFD-Con group and HFD-EPO group in brown adipose tissue (BAT)

A: Comparison of PRDM16 mRNA expression in BAT between HFD-Con group and HFD-EPO group; B and C: Comparison of PRDM16 protein expression in BAT between HFD-Con group and HFD-EPO group; PRDM16: PR domain-containing 16

**P<0.01vsHFD-Con group

2.4 兩組動(dòng)物棕色脂肪組織p-STAT3蛋白質(zhì)水平的比較

HFD-EPO組小鼠p-STAT3/STAT3的蛋白質(zhì)水平為1.300±0.042，明顯高于HFD-Con組小鼠p-STAT3/STAT3蛋白質(zhì)水平(90.920±0.032，P<0.01，圖4A，4B)。

Fig.4Comparison of p-STAT3/STAT3 level between HFD-Con group and HFD-EPO group

p-STAT3: phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3

**P<0.01vsHFD-Con group

2.5 兩組動(dòng)物棕色脂肪組織FGF21 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的比較

腹腔注射EPO4周后，HFD-EPO組小鼠FGF21mRNA水平為0.919±0.029，明顯高于HFD-Con組小鼠FGF21 mRNA水平(0.593±0.025，P<0.01，圖5A)。HFD-EPO組小鼠FGF21蛋白質(zhì)表達(dá)量為0.560±0.012，明顯高于HFD-Con組小鼠FGF21蛋白質(zhì)表達(dá)量(0.314±0.025，P<0.01，圖5B，5C)。

Fig.5Comparison of FGF21 mRNA and protein levelin BAT, liver and plasma between HFD-Con group and HFD-EPO group

A: Comparison of FGF21 mRNA expression in BAT between HFD-Con group and HFD-EPO group; B and C: Comparison of FGF21 protein expression in BAT between HFD-Con group and HFD-EPO group; D: Comparison of FGF21 mRNA expression in liver between HFD-Con group and HFD-EPO group; E: Comparison of FGF21 level in plasma between HFD-Con group and HFD-EPO group; FGF21: Fibroblast growth factor 21

**P<0.01vsHFD-Con group

3 討論

長(zhǎng)期的能量過(guò)量攝入會(huì)導(dǎo)致肥胖及相關(guān)代謝性疾病的產(chǎn)生，如何治療肥胖并多角度闡述肥胖發(fā)生的機(jī)制，一直是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[11-14]。BAT通過(guò)甘油、脂肪酸以及葡萄糖為機(jī)體供能[15]，近年來(lái)BAT作為對(duì)抗肥胖以及2型糖尿病的靶點(diǎn)受到越來(lái)越多的關(guān)注。本研究以高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠為模型，與對(duì)照組比較，小鼠腹腔注射EPO 4周后體重顯著減少、血糖含量顯著下降、糖耐量水平顯著改善，但血漿胰島素水平卻無(wú)明顯變化；BAT中PRDM16、STAT3磷酸化水平、FGF21 mRNA以及蛋白質(zhì)的表達(dá)均顯著升高，說(shuō)明BAT有可能作為EPO的靶點(diǎn)，其細(xì)胞內(nèi)的PRDM16、p-STAT3、FGF21的表達(dá)變化參與了模型小鼠糖代謝狀態(tài)的改善。

既往研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射EPO能改善高脂喂養(yǎng)動(dòng)物模型的代謝狀態(tài)。本研究中EPO注射劑量低于以往研究用的注射劑量[3,16,17]，但EPO對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的高脂喂養(yǎng)動(dòng)物模型依舊有抵抗肥胖及改善糖尿病狀況的效應(yīng)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，與HFD-Con組比較，HFD-EPO組小鼠的腹腔注射糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)有明顯改善，這一改善并未影響血漿胰島素水平。據(jù)此推測(cè)，在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠模型中，EPO的作用可能并未通過(guò)改變血漿胰島素水平而影響血糖水平，BAT可能在EPO改善血糖平衡中起著重要作用。

PRDM16是BAT中驅(qū)動(dòng)棕色脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其作用在于驅(qū)動(dòng)肌源性脂肪細(xì)胞前體轉(zhuǎn)化為棕色脂肪細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，在棕色脂肪細(xì)胞脂質(zhì)生成的過(guò)程中，PRDM16不僅調(diào)控棕色脂肪細(xì)胞脂質(zhì)的生成，并且保證著棕色脂肪細(xì)胞的同質(zhì)性；缺失PRDM16的棕色脂肪前體細(xì)胞導(dǎo)致嚙齒類(lèi)動(dòng)物棕色脂肪組織的含量減少，同時(shí)缺失PRDM16的棕色脂肪細(xì)胞表現(xiàn)出產(chǎn)熱相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)的減少[18]。以上結(jié)果均證實(shí)，PRDM16對(duì)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)的合成及功能起著至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于HFD-Con組，HFD-EPO組小鼠BAT中PRDM16在mRNA水平與蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均顯著增加，推測(cè)腹腔注射EPO與BAT含量增加有關(guān)。

真核細(xì)胞中豐富的STAT信號(hào)通路與細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、分化、發(fā)展有著密切關(guān)系[19-20]。研究證實(shí)，綁定于PRDM16的STAT3能夠通過(guò)改變自身的磷酸化狀態(tài)而穩(wěn)定BAT中的PRDM16[20]。本研究中，與HFD-Con組相比，HFD-EPO組小鼠BAT中p-STAT3/STAT3的比率顯著增加。

FGF21是一種肝臟分泌的代謝調(diào)控子的激素，是內(nèi)分泌FGF1家族中的一員，其作用與改善胰島素抵抗及葡萄糖代謝有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，BAT也能合成FGF21。本研究中，與對(duì)照組相比，腹腔注射EPO小鼠BAT中FGF21 mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均升高，血漿FGF21水平升高，而肝臟中FGF21水平并無(wú)明顯改變。以上結(jié)果說(shuō)明，EPO對(duì)血糖的調(diào)控作用有可能來(lái)自于BAT活化后FGF21的合成并分泌。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)用高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠為模型，腹腔注射EPO 4周后發(fā)現(xiàn)：HFD-EPO組小鼠的體重顯著降低，血糖水平、糖耐量水平均有顯著改善，但血漿胰島素含量無(wú)顯著變化；BAT中PRDM16、p-STAT、FGF21的mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著增加，三者的變化可能與HFD-EPO小鼠血糖降低有關(guān)，為揭示肥胖患者的糖尿病發(fā)病機(jī)制提供了依據(jù)。