張 俊，石德順，陸鳳花

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530000）

20 世紀80 年代后期，為了盡可能模擬體內(nèi)細胞培養(yǎng)的微環(huán)境，人們在細胞培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上衍生出細胞共培養(yǎng)技術(shù)。細胞共培養(yǎng)是指將2 種或2 種以上細胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中，包括直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)，由于共培養(yǎng)體系與體內(nèi)環(huán)境較吻合，便于細胞之間相互信息交流溝通，具有相互支撐生長增殖等優(yōu)點，因此被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代細胞培養(yǎng)研究中。哺乳動物卵母體外成熟一直是研究卵母細胞體外培養(yǎng)、體外受精和胚胎發(fā)育等關(guān)鍵步驟，也一直是研究熱點和難點。與卵母細胞體內(nèi)成熟相比，卵母細胞體外成熟存在細胞核和細胞質(zhì)成熟不協(xié)調(diào)、不同步問題，這直接導(dǎo)致卵子發(fā)育潛力受阻，表現(xiàn)為體外受精胚胎發(fā)育率低和胚胎質(zhì)量差等。哺乳動物卵母細胞體外成熟質(zhì)量差與卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系不完善有密切關(guān)系，因此，致力于卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系的完善，盡可能模擬卵母細胞體內(nèi)成熟環(huán)境，一直是研究卵母細胞體外成熟的重要內(nèi)容。在體內(nèi)卵母細胞的成熟是與卵泡細胞共培養(yǎng)的環(huán)境，而細胞共培養(yǎng)技術(shù)具有利用細胞的代謝產(chǎn)物和促進胚胎早期發(fā)育的作用。因此，為了提高哺乳動物卵母細胞體外成熟的效果，近年來關(guān)于哺乳動物卵母細胞體外成熟與多種細胞共培養(yǎng)的研究有諸多報道。本文主要從卵母細胞體外成熟與卵泡細胞共培養(yǎng)、與裸卵共培養(yǎng)和與間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)3 個方面綜述共培養(yǎng)體系對哺乳動物卵母細胞體外成熟的作用，為共培養(yǎng)體系用于大家畜甚至人卵母細胞體外成熟奠定基礎(chǔ)。

1 卵泡細胞共培養(yǎng)對哺乳卵母細胞體外成熟的影響

卵母細胞在體內(nèi)成熟時，外部主要被卵泡細胞包圍，這些卵泡細胞包括顆粒細胞、卵丘細胞和卵泡內(nèi)膜細胞，三者在卵母細胞體內(nèi)成熟中不僅具有物理的立體支撐作用，而且能分泌卵母細胞體內(nèi)成熟所需要的一些細胞因子和生長因子，如次黃嘌呤、cAMP 等，相關(guān)細胞因子在維持卵母細胞成熟阻滯中起到至關(guān)重要作用。因此，為了最大限度模擬卵母細胞體內(nèi)成熟的環(huán)境，有關(guān)卵泡細胞與卵母細胞成熟共培養(yǎng)的研究越來越多。

目前，卵泡細胞共培養(yǎng)用于哺乳動物卵母細胞體外成熟的研究主要集中在綿羊、豬等家畜和人上。Adeldust 等[1]研究了綿羊卵母細胞體外成熟與顆粒細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)顆粒細胞共培養(yǎng)可明顯提高綿羊卵母細胞發(fā)育至MII 期比率和卵裂率。豬卵母細胞體外成熟時，適宜細胞密度的卵丘細胞與豬卵母細胞成熟共培養(yǎng)，能提高體外受精（IVF）和孤雌激活（PA）胚胎的發(fā)育潛力，原因是共培養(yǎng)體系可改變卵母細胞特定基因的表達，提高細胞內(nèi)谷胱甘肽含量，從而提高卵母細胞體外成熟效率[2]。在豬卵母細胞冷凍研究中發(fā)現(xiàn)，冷凍復(fù)蘇后未成熟卵母細胞與豬顆粒細胞共培養(yǎng)后能增強細胞核和細胞質(zhì)成熟效果，明顯提高體外受精和卵胞漿單精子顯微注射（ICSI）胚胎發(fā)育能力[3]。也有研究發(fā)現(xiàn)，使用犬卵丘細胞和輸卵管與豬卵母細胞成熟共培養(yǎng)，可創(chuàng)造適宜卵母細胞成熟的微環(huán)境，顯著降低卵母細胞凋亡水平和細胞內(nèi)活性氧水平，增強卵母細胞成熟效果進而提高PA 胚胎發(fā)育潛力[4]。石德順等[5]在牛卵泡內(nèi)膜細胞的系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)膜細胞及其條件液均能提高牛卵母細胞體外成熟率、受精卵裂率和囊胚率。研究共培養(yǎng)體系提高人卵母細胞體外成熟效率，這對臨床輔助生殖技術(shù)具有重要意義。Jahromi 等[6]研究指出，人顆粒細胞與卵母細胞共培養(yǎng)可顯著提高ISCI 胚胎發(fā)育速度、發(fā)育質(zhì)量和囊胚率，但對受精率沒有顯著影響。使用同一個體人成熟卵母細胞的卵丘細胞與未成熟卵母細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系可在一定程度為卵母細胞成熟提供卵泡微環(huán)境，進而影響胚胎發(fā)育、表觀遺傳和細胞周期等相關(guān)基因表達，從而提高卵母細胞成熟率，甚至可達到卵母細胞體內(nèi)成熟相似水平[7]。截止目前，關(guān)于哺乳動物卵母細胞成熟與卵泡細胞共培養(yǎng)的研究相對較多，但大多數(shù)共培養(yǎng)體系集中于顆粒細胞和卵丘細胞，而且都是使用本物種來源細胞與卵母細胞成熟共培養(yǎng)。對于卵泡細胞共培養(yǎng)影響卵母細胞體外成熟的具體機理研究相對較少，且不夠系統(tǒng)和深入，有待進一步研究。

2 裸卵共培養(yǎng)對哺乳卵母細胞體外成熟的影響

卵母細胞成熟時卵母細胞和卵泡細胞之間相互影響，因此，在研究卵泡細胞共培養(yǎng)旁分泌作用對卵母細胞成熟影響同時，也應(yīng)更關(guān)注卵母細胞自分泌作用對卵母細胞成熟的影響，有關(guān)裸卵共培養(yǎng)的研究主要集中在豬、牛和水牛上。裸卵共培養(yǎng)是指在卵母細胞體外成熟時，使用沒有卵丘細胞包裹的未成熟卵母細胞與卵丘卵母細胞復(fù)合體一起培養(yǎng)的方式，研究卵母細胞自身分泌母源性因子對卵母細胞體外成熟的作用。

Morselli 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，家貓裸卵在3D 培養(yǎng)系統(tǒng)與家貓卵母細胞共培養(yǎng)能提高卵母細胞減數(shù)分裂能力和后續(xù)胚胎發(fā)育潛力，這可能與裸卵能分泌的一些相關(guān)因子（母源性因子）影響卵母細胞成熟有關(guān)。豬卵母細胞體外成熟與裸卵共培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，適宜裸卵與卵母細胞比例（9:16）共培養(yǎng)可提高豬卵母細胞成熟卵丘擴展和維持減數(shù)分裂阻滯，這可能是卵母細胞分泌因子和卵母細胞卵丘細胞之間縫隙連接所引起[9]。但Appeltant 等[10]研究表明，不論豬裸卵和卵母細胞比例如何，裸卵共培養(yǎng)不能提高豬卵母細胞成熟效果、受精率和胚胎發(fā)育。也有研究表明，豬形態(tài)較好卵母細胞與較差卵母細胞共培養(yǎng)，可顯著提高形態(tài)較差卵母細胞成熟效果和胚胎發(fā)育能力，從而提高豬形態(tài)較差卵母細胞的利用率[11]。牛卵母細胞成熟與裸卵共培養(yǎng)時，共培養(yǎng)體系能提高牛體細胞核移植（SCNT）胚胎發(fā)育能力和胚胎質(zhì)量，基本達到IVF 胚胎發(fā)育水平[12]。同時，牛卵母細胞成熟與裸卵共培養(yǎng)，顯著提高核移植胚胎發(fā)育能力和質(zhì)量，且共培養(yǎng)組胚胎發(fā)育相關(guān)基因甲基化和乙?；脚cIVF 組胚胎相當[13]。水牛卵母細胞成熟與裸卵共培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，水牛裸卵共培養(yǎng)卵母細胞分泌因子能提高水牛卵丘細胞凋亡水平和激活細胞cAMP 產(chǎn)生，但對類固醇生成沒有影響，這可能是卵母細胞分泌因子影響卵丘細胞糖酵解和縫隙連接所致[14]。卵丘細胞與裸卵共培養(yǎng)可顯著提高裸卵發(fā)育潛力（卵裂率、囊胚率），這可能與二者共培養(yǎng)影響卵母細胞凋亡、改變細胞內(nèi)cAMP和MPF 活力以及管控合子基因影響受精率進而影響卵母細胞成熟有關(guān)[15]。目前卵母細胞成熟與裸卵共培養(yǎng)的研究很少，且在哺乳動物卵母細胞進行體外成熟時一般認為出現(xiàn)裸卵是由于操作人員技術(shù)所導(dǎo)致，因而忽略了裸卵所起到的作用。上述研究表明，適當比例的裸卵與卵母細胞共培養(yǎng)可促進卵母細胞體外成熟，但是裸卵具體影響卵母細胞成熟時卵丘的擴展、卵丘與卵母細胞間縫隙連接還是卵母細胞本身成熟，目前有待具體進行研究。

3 間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)影響哺乳卵母細胞體外成熟

卵母細胞體內(nèi)成熟時主要被卵泡細胞包裹，因而上述共培養(yǎng)體系均建立在模擬卵母細胞成熟的體內(nèi)環(huán)境基礎(chǔ)上，但不止卵泡細胞共培養(yǎng)能提高卵母細胞體外成熟效果，其他來源細胞與卵母細胞成熟共培養(yǎng)也可提高卵母細胞體外成熟效率，如間充質(zhì)干細胞。間充質(zhì)干細胞具有免疫特性，分泌多種生物活性物質(zhì)如細胞因子和生長因子（MCP-1、VEGF-A、EGF、FGF-2、IL-6、LIF和TGFβ等），而有些生物活性物質(zhì)可提高卵母細胞減數(shù)分裂能力、卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育潛能。Ling 等[16]在小鼠卵母細胞成熟液中添加小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BMSC 條件液可促進小鼠腔前卵泡發(fā)育，提高卵母細胞減數(shù)分裂能力、激素產(chǎn)生和皮質(zhì)顆粒分布等，因此，BMSC 共培養(yǎng)明顯提高小鼠腔前卵泡發(fā)育、卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育潛力。豬卵母細胞成熟共培養(yǎng)的研究表明，人脂肪間充質(zhì)干細胞（ADSC）與豬卵母成熟共培養(yǎng)，能顯著提高豬卵母細胞成熟效果和胚胎發(fā)育能力，同時年輕供者來源ADSC 的共培養(yǎng)成熟效果較年老供者來源ADSC 顯著提高[17]。間充質(zhì)干細胞在人上的研究相對很多，目前主要集中于研究間充質(zhì)干細胞用于細胞治療、組織工程和器官移植等方面。間充質(zhì)干細胞用于疤痕修復(fù)和卵巢早衰研究中，也采用間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)的方式利用間充質(zhì)干細胞可分泌某些生物活性因子從而發(fā)揮作用。但目前使用人間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)，用于人卵母細胞體外成熟的研究尚未見報道。

4 間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)影響哺乳動物腔前卵泡發(fā)育

卵母細胞成熟與卵泡發(fā)育密切相關(guān)，卵泡發(fā)育是指卵泡由原始卵泡發(fā)育成為初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡的生理過程，在卵泡發(fā)育過程中，卵泡內(nèi)膜細胞分布有許多血管，參與雌激素的合成。同時，顆粒細胞和內(nèi)膜細胞分泌一些生長因子、細胞因子等，共同調(diào)控卵泡的發(fā)育。

研究哺乳動物腔前卵泡體外培養(yǎng)，可為哺乳動物提供更豐富卵母細胞來源。有研究表明，使用人骨髓間充質(zhì)干細胞與人腔前卵泡共培養(yǎng)，可為腔前卵泡提供合適的發(fā)育微環(huán)境，并顯著提高卵泡存活率、生長速度和生存能力；深入研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)體系可顯著上調(diào)卵泡發(fā)育中卵母細胞GDF9、BMP15表達，顆粒細胞inhibitβA、TGFβ1表達[18]。Rajabi 等[19]研究人月經(jīng)血間充質(zhì)干細胞與小鼠腔前卵泡在3D 系統(tǒng)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系可提高小鼠腔前卵泡生長成熟和IVF 胚胎發(fā)育潛力，包括卵泡存活率、卵泡腔的形成、雌二醇和孕酮激素水平，同時上調(diào)GDF9和BMP15表達，下調(diào)Mater表達。最新研究表明，小鼠腔前卵泡在3D 系統(tǒng)與小鼠ADSC 共培養(yǎng)，可顯著提高小鼠腔前卵泡存活、生長發(fā)育和減數(shù)分裂能力，這為研究人自體ADSC 用于人腔前卵泡共培養(yǎng)提供理論依據(jù)[20]。小鼠卵巢內(nèi)皮細胞與小鼠卵泡發(fā)育共培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，被激活卵巢內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)可提高早期卵泡的發(fā)育和存活能力，這為研究早期卵泡發(fā)育成熟以及內(nèi)皮細胞與卵泡之間聯(lián)系提供良好平臺[21]。間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)促進哺乳動物腔前卵泡發(fā)育的相關(guān)研究，從卵泡發(fā)育的角度間接說明了共培養(yǎng)體系起到促進哺乳動物卵母細胞體外成熟的作用。

5 展 望

哺乳動物卵母細胞的體外成熟一直是制約胚胎工程技術(shù)發(fā)展的難點，也一直是研究的熱點。目前，哺乳動物卵母細胞體外成熟雖然已經(jīng)進行大量系統(tǒng)的研究，但卵母細胞體外成熟效果與體內(nèi)相比仍然不理想，因此，從細胞共培養(yǎng)體系的角度出發(fā)，在體外盡可能模擬體內(nèi)卵母細胞成熟的微環(huán)境，是目前體外培養(yǎng)卵母細胞成熟的有效方法，且共培養(yǎng)體系可用同種或異種動物細胞與卵母細胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)細胞不止局限于顆粒細胞、內(nèi)膜細胞，也包括間充質(zhì)干細胞等。但目前共培養(yǎng)體系對哺乳動物卵母細胞體外成熟作用的具體機理不清楚，無法在體外對共培養(yǎng)體系進行精細調(diào)控以進一步提高卵母細胞的體外成熟效率。隨著共培養(yǎng)體系的研究越來越深入和系統(tǒng)，共培養(yǎng)體系的作用機制越來越明晰，共培養(yǎng)體系提高卵母細胞體外成熟效率會更加精準，共培養(yǎng)體系可廣泛應(yīng)用于哺乳動物卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)，甚至人卵母細胞體外成熟培養(yǎng)中。