王志旺， 付曉艷， 姚 楠， 鞏子漢， 程小麗， 段海婧， 任 遠(yuǎn)

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)， 蘭州 730000; 2. 甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是氣道慢性炎癥性疾病，目前雖有抗炎平喘藥、支氣管擴(kuò)張藥等藥物用于臨床，但哮喘的發(fā)病率與死亡率并未隨之降低[1]。糖皮質(zhì)激素(簡(jiǎn)稱(chēng)激素)是目前治療哮喘，特別是重癥哮喘，的常用藥，但用藥過(guò)程中可提高血液黏稠度，縮短凝血時(shí)間。中藥當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血之功效，研究證實(shí)當(dāng)歸可改善血液流變學(xué)[2]；另一方面《神農(nóng)本草經(jīng)》謂當(dāng)歸“主咳逆上氣”，臨床上可用于治療哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病，目前研究顯示當(dāng)歸及其揮發(fā)油對(duì)哮喘有明顯的治療作用[3]。本實(shí)驗(yàn)擬將當(dāng)歸與激素合用治療哮喘小鼠模型，通過(guò)考察平喘指標(biāo)與血液流變學(xué)指標(biāo)，探討當(dāng)歸與激素在治療哮喘中的增效(平喘)減副(改善血液流變學(xué))作用；同時(shí)，從HMGB1/TLR4/NF-κB通路來(lái)探討當(dāng)歸與激素治療哮喘的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

當(dāng)歸(RASI)采自甘肅省岷縣，經(jīng)楊扶德教授鑒定為Radix Angelicae Sinensis的干燥根，加工成飲片后用水煎煮，取濾液適當(dāng)濃縮后冷藏備用；注射用氫化可的松琥珀酸鈉(hydrocortisone sodium succinate, HSS)，天津生物化學(xué)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020493，批號(hào)：011606014。卵白蛋白(ovalbumin，OVA)、氯化乙酰膽堿(acetylcholine chloride, Ach)及磷酸組胺(histamine phosphate, Hist)，Sigma公司，批號(hào)：SLBQ8172V、BCBR3675V、BCBR3675V。氫氧化鋁，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20161003。TNF-α、IL-1β及IL-6試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170404、20170501、20170403；TXB2試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)：170220。HMGB1 Polyclonal antibody，ImmunoWay公司，批號(hào)：B0201；抗TLR4 antibody、抗NF-κB p65 antibody，Genetex公司，批號(hào)：821701346、41556。

1.2 儀器

鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系統(tǒng)(CH Technologies)，402AI型超聲霧化器(江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)，EMKA型動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)(北京廣源達(dá)科技發(fā)展有限公司)，LBY-N6 COMPACT全自動(dòng)血液流變儀(北京普利生儀器有限公司)，Velocity 18R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Dynamica公司)，CH-212型光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠，雌雄各半，體重(16～19)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，許可證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001。

1.4 分組、造模并給藥

將小鼠隨機(jī)分為6組(n=12)，即對(duì)照(control)組、血瘀模型(blood stasis model)組、哮喘模型(asthma model)組、氫化可的松(HSS, 0.05 g/kg氫化可的松)組、當(dāng)歸(RASI, 8 g/kg當(dāng)歸)組、合用(RASI+HSS, 8 g/kg當(dāng)歸與0.05 g/kg氫化可的松合用)組。根據(jù)文獻(xiàn)復(fù)制哮喘模型[4]，實(shí)驗(yàn)第1、8天，哮喘模型組、氫化可的松組、當(dāng)歸組、合用組小鼠各腹腔注射OVA致敏液0.2 ml (含100 μg OVA、2 mg氫氧化鋁的生理鹽水懸液)，同時(shí)背部皮下注射等量致敏液，對(duì)照組與血瘀模型組以生理鹽水替代致敏。第15天開(kāi)始激發(fā)，讓小鼠吸入1% OVA激發(fā)液20 min，1次/d，連續(xù)7 d，對(duì)照組與血瘀模型組以生理鹽水替代。從激發(fā)開(kāi)始，每次激發(fā)前1 h，灌胃下述藥物：當(dāng)歸組與合用組小鼠每天給予8 g/kg當(dāng)歸；血瘀模型組、氫化可的松組及合用組從激發(fā)第3天開(kāi)始每次激發(fā)前1 h給予0.05 g/kg氫化可的松灌胃，1次/d，連續(xù)5 d。

1.5 肺功能測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第22天測(cè)定肺功能。調(diào)試肺功能儀。將小鼠放入封閉系統(tǒng)中，啟動(dòng)系統(tǒng)，待小鼠安靜后記錄潮氣量、呼吸峰與吸氣峰流量等肺功能指標(biāo)。

1.6 哮喘行為學(xué)實(shí)驗(yàn)[5]

實(shí)驗(yàn)第19天，按上述激發(fā)方法，讓小鼠吸入Hist與Ach混合激發(fā)液(含0.2% Hist與2% Ach) 120 s，觀察10 min內(nèi)小鼠抓鼻次數(shù)、撓癢次數(shù)及哮喘發(fā)作癥狀等哮喘行為學(xué)指標(biāo)。小鼠抓鼻或撓癢次數(shù)0、1～3、4～6、7次以上分別記0、1、2、3分；小鼠無(wú)哮喘癥狀、出現(xiàn)輕微哮喘癥狀、出現(xiàn)呼吸急促或呼吸頻率明顯加快或焦躁不安等哮喘癥狀、出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸困難等哮喘癥狀分別記0、3、6、9分。

1.7 采集標(biāo)本、測(cè)定指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)第22天，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，眼眶后靜脈叢采血，部分血液抗凝后測(cè)定全血黏度，部分血液凝固后分離血清測(cè)定TXB2水平。處死動(dòng)物，手術(shù)暴露氣管，結(jié)扎左支氣管，提取支氣管肺泡灌洗液(BALF)，離心后取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。摘取肺臟、稱(chēng)重，于固定位置取左肺組織，經(jīng)免疫組化染色后觀測(cè)HMGB1、TLR4及NF-κB p65表達(dá)水平并進(jìn)行半定量分析，另取部分左肺組織精密稱(chēng)重，干燥至恒重后稱(chēng)重，計(jì)算肺組織含水量。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸、氫化可的松及其合用對(duì)哮喘小鼠全血黏度及血清TXB2的影響

血瘀模型組、氫化可的松組小鼠在低切、中切與高切時(shí)的全血黏度與血清TXB2含量明顯升高。與對(duì)照組比較，血瘀模型組小鼠低切、中切與高切時(shí)的全血黏度及血清TXB2含量明顯升高(P<0.05,P<0.01)；與哮喘模型組比較，氫化可的松組小鼠中切與高切時(shí)的全血黏度及血清TXB2含量明顯升高(P<0.05,P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)”，但氫化可的松組低切血黏度并無(wú)差異。與氫化可的松組比較，合用組小鼠的全血黏度與血清TXB2含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，提示RASI與HSS合用治療哮喘可明顯降低全血黏度，對(duì)抗單獨(dú)使用HSS治療時(shí)提高全血黏度的作用。

Tab. 1 Effects of RASI, HSS and their combination on whole blood viscosity and TXB2 content in serum of asthmatic mice ±s, n=12)

RASI: Radix Angelicae Sinensis; HSS: Hydrocortisone sodium succinate; TXB2: Thromboxane B2

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsasthma model group;△P<0.05,△△P<0.01vsHSS group

2.2 當(dāng)歸、氫化可的松及其合用對(duì)小鼠哮喘行為學(xué)的影響

與對(duì)照組比較，在Hist與Ach混合激發(fā)液的激發(fā)下，哮喘模型組小鼠的抓鼻次數(shù)與撓癢次數(shù)明顯增多，哮喘發(fā)作程度明顯加重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。與哮喘模型組比較，在當(dāng)歸、氫化可的松及二者合用的干預(yù)下，小鼠上述哮喘指標(biāo)得到明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。合用組的作用有進(jìn)一步增強(qiáng)的趨勢(shì)，但與當(dāng)歸組、氫化可的松組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

GroupGrabing nose(times)Scratching(times)Asthma degreeControl8.92±5.702.08±2.500.75±1.36Blood stasis8.75±5.532.25±2.050.75±1.36Asthma13.83±5.31*5.17±2.79**3.25±1.54**HSS7.33±3.75##1.92±2.54##0.75±1.36##RASI8.50±3.50##2.00±2.59##1.25±1.54##RASI+HSS6.73±4.71##1.36±2.16##0.75±1.36##

RASI: Radix Angelicae Sinensis; HSS: Hydrocortisone sodium succinate

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsasthma model group

2.3 當(dāng)歸、氫化可的松及其合用對(duì)哮喘小鼠肺功能的影響

與對(duì)照組比較，哮喘模型組小鼠潮氣量(TV)、吸氣峰流量(PIF)及呼氣峰流量(PEF)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 表3)。與哮喘模型組比較，在當(dāng)歸、氫化可的松及其合用的干預(yù)下，TV、PIF及PEF明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01, 表3)；合用組肺功能的改善作用更強(qiáng)，與當(dāng)歸組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

GroupTV (ml)PIF (ml/s)PEF (ml/s)Control0.117±0.01864.28±8.46108.34±26.07Blood stasis0.115±0.01661.04±7.91103.65±25.78Asthma0.084±0.011**44.68±4.95**62.21±13.64**HSS0.105±0.015##55.67±6.03**##85.14±16.84*##RASI0.096±0.013**#49.61±5.44**#76.35±15.92**#RASI+HSS0.112±0.016##△58.59±6.75##△△92.08±18.44##△

RASI: Radix Angelicae Sinensis; HSS: Hydrocortisone sodium succinate; TV: Tidal volume; PIF: Peak inspiratory flow; PEF: Peak expiratory flow

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsasthma model group;△P<0.05,△△P<0.01vsRASI group

2.4 當(dāng)歸、氫化可的松及其合用對(duì)哮喘小鼠肺指數(shù)及肺組織含水量的影響

與對(duì)照組比較，哮喘模型組小鼠的肺指數(shù)及肺組織濕/干重比值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01, 表4)。與哮喘模型組比較，在當(dāng)歸、氫化可的松及其合用的干預(yù)下，肺指數(shù)及肺濕/干重比值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)；合用組肺指數(shù)及肺濕/干重比值呈現(xiàn)更明顯的下降趨勢(shì)，但與當(dāng)歸組、氫化可的松組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

GroupLung index (%)Wet dry weight ratio of lungControl0.665±0.1222.93±1.31Blood stasis0.651±0.1192.87±1.28Asthma0.988±0.191**5.64±1.56**HSS0.752±0.157##3.44±1.45##RASI0.796±0.179*#3.90±1.49#RASI+HSS0.725±0.133##3.07±1.40##

RASI: Radix Angelicae Sinensis; HSS: Hydrocortisone sodium succinate

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsasthma model group

2.5 當(dāng)歸、氫化可的松及其合用對(duì)哮喘小鼠BALF中細(xì)胞因子的影響

與對(duì)照組比較，哮喘模型組小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6顯著升高(P<0.01，表5)。與哮喘模型組比較，經(jīng)當(dāng)歸、氫化可的松及其合用干預(yù)后，TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯下降(P<0.01)；合用組比當(dāng)歸組降幅更大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 當(dāng)歸、氫化可的松及其合用對(duì)哮喘小鼠肺組織HMGB1/TLR4/NF-κB通路表達(dá)的影響

如圖1、圖2、圖3所示，棕黃色為HMGB1、TLR4及NF-κB p65表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞：HMGB1主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞和炎細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，TLR4主要表達(dá)于上述細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中，而NF-κB p65主要表達(dá)于上述細(xì)胞的細(xì)胞核中。對(duì)照組小鼠HMGB1、TLR4及NF-κB p65呈弱陽(yáng)性表達(dá)，而在哮喘模型組小鼠表達(dá)明顯增強(qiáng)；在當(dāng)歸、氫化可的松及其合用的干預(yù)下，HMGB1、TLR4及NF-κB p65的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的減弱。對(duì)HMGB1、TLR4及NF-κB p65表達(dá)進(jìn)行半定量分析的結(jié)果顯示，哮喘模型組HMGB1、TLR4及NF-κB p65表達(dá)的平均吸光度值明顯升高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01, 圖1、圖2、圖3、表6)。在當(dāng)歸、氫化可的松及其合用的干預(yù)下，HMGB1、TLR4及NF-κB p65表達(dá)的平均吸光度值下降，TLR4及NF-κB p65與哮喘模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)；合用組的下降幅度更大，與當(dāng)歸組、氫化可的松組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Tab. 5 Effects of RASI, HSS and their combination on cytokines in BALF of asthmatic mice (pg/ml, ±s, n=12)

RASI: Radix Angelicae Sinensis; HSS: Hydrocortisone sodium succinate; BALF: Broncho-alveolar lavage fluid; TNF-α: Tumor necrosis factor-α; IL-1β: Interleukin-1β; IL-6: Interleukin-6

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsasthma model group;△P<0.05,△△P<0.01vsRASI+HSS group

Fig.1Effects of RASI, HSS and their combination on the expression of HMGB1 in asthmatic mice (×40)

A: Control group; B: Blood stasis model group; C: Asthma model group; D: HSS group; E: RASI group; F: RASI + HSS group

Fig.2Effects of RASI, HSS and their combination on the expression of TLR4 in asthmatic mice (×40)

A: Control group; B: Blood stasis model group; C: Asthma model group; D: HSS group; E: RASI group; F: RASI + HSS group

Fig.3Effects of RASI, HSS and their combination on the expression of NF-κB p65 in asthmatic mice (×40)

A: Control group; B: Blood stasis model group; C: Asthma model group; D: HSS group; E: RASI group; F: RASI + HSS group

Tab. 6 Effects of RASI, HSS and their combination on the expression of HMGB1, TLR4 and NF-κB p65 in asthmatic mice ±s, n=12)

RASI: Radix Angelicae Sinensis; HSS: Hydrocortisone sodium succinate; HMGB1: High-mobility group box 1; TLR4: Toll-like receptors 4; NF-κB p65: Nuclear factor-κB p65

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsasthma model group;△△P<0.01vsRASI+HSS group

3 討論

當(dāng)歸是臨床常用中藥，具有“補(bǔ)血活血”之功效，素有“十方九歸”之說(shuō)?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》開(kāi)篇就說(shuō)當(dāng)歸“主咳逆上氣”，即當(dāng)歸可用于治療支氣管哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病，臨床上當(dāng)歸與其他中藥配伍成復(fù)方，如《和劑局方》中的蘇子降氣湯、《慎齋醫(yī)書(shū)》中的百合固金湯和《醫(yī)學(xué)入門(mén)》中的加味益母丸等，當(dāng)歸在其中發(fā)揮補(bǔ)血養(yǎng)陰潤(rùn)肺、活血通脈降氣等功效。藥理學(xué)研究顯示，當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)氣管平滑肌有顯著的解痙作用[6]，在體研究顯示當(dāng)歸(8 g/kg)對(duì)哮喘小鼠模型有明顯的平喘作用[7]。糖皮質(zhì)激素(簡(jiǎn)稱(chēng)激素)是目前治療哮喘的常用藥，其抗炎等作用可明顯緩解哮喘的臨床癥狀；但激素可提高血液的黏稠度，在臨床上易引起不良反應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)中可用來(lái)復(fù)制血瘀動(dòng)物模型。本次實(shí)驗(yàn)采用大劑量氫化可的松(0.05 g/kg)來(lái)復(fù)制血瘀動(dòng)物模型，同時(shí)采用該劑量來(lái)治療哮喘，對(duì)比觀察當(dāng)歸、激素及其合用對(duì)哮喘的治療作用。結(jié)果顯示，當(dāng)歸、激素及其合用能明顯降低哮喘發(fā)作程度，減少哮喘小鼠的抓鼻次數(shù)與撓癢次數(shù)，增加潮氣量、吸氣峰流量及呼氣峰流量，改善肺功能，降低肺指數(shù)及肺組織含水量；當(dāng)歸與激素合用后能明顯提高肺功能，作用優(yōu)于RASI組，上述其他作用僅出現(xiàn)進(jìn)一步增強(qiáng)的趨勢(shì)。

高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種非常保守的非組核蛋白，廣泛分布于機(jī)體多種組織的細(xì)胞核中，核內(nèi)的HMGB1主要調(diào)控DNA的復(fù)制及RNA的轉(zhuǎn)錄[8]。在TNF-α、IL-1及IL-6等細(xì)胞因子的刺激下，HMGB1釋放至胞外，與細(xì)胞膜Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)結(jié)合，激活核因子-κB(NF-κB)等下游信號(hào)通路，引起上述細(xì)胞因子的釋放，通過(guò)正反饋機(jī)制促進(jìn)炎癥反應(yīng)[9]。在卵白蛋白復(fù)制的哮喘小鼠模型中，TLR4被激活，而HMGB1抗體可減輕其肺組織炎癥[10]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種促炎細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎細(xì)胞聚集，刺激其釋放大量IL-6等炎性因子，參與哮喘氣道的炎癥反應(yīng)及其重塑[11]。白介素-6(IL-6)是一種小分子量活性多肽，在炎癥反應(yīng)中參與急性期反應(yīng)蛋白的合成，活化T細(xì)胞以及終末分化B細(xì)胞，是氣道炎癥反應(yīng)過(guò)程中的重要因子[12]。白介素-1(IL-1)主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其中IL-1β又名淋巴細(xì)胞活化因子，可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞并浸潤(rùn)至氣道黏膜，加速其脫顆粒而誘發(fā)哮喘[13]。本實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)歸、激素及其合用能明顯抑制HMGB1/TLR4/NF-κB蛋白質(zhì)的表達(dá)，降低BALF中TNF-α、IL-1β及IL-6的水平；當(dāng)歸與激素合用后對(duì)TNF-α、IL-1β、IL-6及TLR4/NF-κB的調(diào)節(jié)作用進(jìn)一步增強(qiáng)。

糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘，特別是重癥哮喘，的常用藥，但在用藥過(guò)程中可提高血液粘稠度，縮短凝血時(shí)間，對(duì)支氣管哮喘、肺纖維化、肺動(dòng)脈高壓及肺心病患者不利[14]。血栓素A2(TXA2)是一種強(qiáng)烈促進(jìn)血管收縮和血小板聚集的活性物質(zhì)，同時(shí)TXA2也是重要的炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)炎細(xì)胞浸潤(rùn)而加重肺組織炎癥反應(yīng)[15]。TXA2性質(zhì)不穩(wěn)定，迅速轉(zhuǎn)化為血栓素B2(TXB2)，TXB2可作為影響血液流變學(xué)的血小板激活指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)歸可緩解激素引起的TXB2活性升高、血液粘稠度增加，故可改善血液流變學(xué)的異常變化。

綜上所述，當(dāng)歸、激素及其合用對(duì)支氣管哮喘有明顯的治療作用，而抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路是其作用機(jī)制之一。此外，合用當(dāng)歸可明顯緩解激素治療哮喘過(guò)程中引起的血液流變學(xué)的異常變化。