夏 翔，宋旆文，牛 楊，楊 超，申才良

嚴重的脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)會造成不同形式的癱瘓，目前來說仍然無十分有效的治療，這帶來了巨大的個人和社會經(jīng)濟損失[1]。近年來隨著干細胞研究的興起，為治療SCI以及類似神經(jīng)系統(tǒng)疾病帶來了新希望。但是研究[2]顯示，損傷后無論是內源性的神經(jīng)干細胞增生，還是移植的外源性神經(jīng)干細胞，均不能有效的分化為神經(jīng)元或者少突膠質細胞等神經(jīng)功能細胞，而是較多的分化為星形膠質細胞。然而星形膠質細胞在損傷局部主要形成膠質瘢痕，阻礙了軸突的再生，抑制了神經(jīng)功能的恢復[3]。研究[4-6]顯示骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)(BMP2/4/7)蛋白在損傷局部高表達，同時高表達的BMP會促進星形膠質細胞的分化，抑制神經(jīng)元的分化。本實驗通過體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)，添加外源性BMP4蛋白以及其受體拮抗劑Noggin蛋白，觀察其對NSCs分化的影響以及探索其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料DMEM/F12 細胞培養(yǎng)液和胎牛血清 (FBS) 以及B-27細胞因子(美國Gibco公司)；細胞表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF) 和堿性細胞成纖維生長因子(basic fbroblast growth factor,bFGF)(美國PeproTech公司)；兔抗小鼠膠質纖維酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體、兔抗小鼠-Id2抗體(美國Abcam公司)；pSamd1/5/8抗體 (美國Cell Signaling公司)；包被用左旋氏多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)(美國Sigma公司)；ECL蛋白顯影液試劑盒、BCA 蛋白定量檢測試劑盒(美國Pierce公司)；Transwell培養(yǎng)板(美國Corning公司)；Dapi、免疫熒光一抗稀釋液、免疫熒光二抗稀釋液、青/鏈霉素溶液、即用型胰蛋白酶細胞消化液、抗熒光淬滅封片液(上海碧云天公司)；BMP-4蛋白(美國Peprotech公司)。18 mm細胞爬片(江蘇世泰公司),超凈工作臺(香港力康公司HFsafe-1200LC Healforce),細胞培養(yǎng)箱(美國希爾頓公司),手術解剖顯微鏡(奧林巴斯SZ51，日本),熒光顯微鏡(尼康80i，日本)。SPF級SD新生乳鼠購自安徽省實驗動物中心。

1.2NSCs的培養(yǎng)取1只24 h內新生SD乳鼠，用70%酒精消毒后斷頭，依次剪開皮膚、顱骨，迅速取出腦組織置于冰上含有預冷PBS液的培養(yǎng)皿中。棄去小腦部分，在解剖顯微鏡的幫助下，徹底去除每個皮層的腦膜以及血管，將清理好的腦組織用眼科剪剪成約1 mm3小碎塊，加入1.5 ml胰酶，將組織和胰酶混懸液置于細胞培養(yǎng)箱中消化7 min，用2 ml含有10% FBS的DMEM/F12終止消化，用微量移液槍輕輕吹打使細胞盡可能分散，200目濾網(wǎng)濾過去除未消化組織，將細胞懸液移入15 ml離心管，然后1 000 r/min離心5 min，再次加入適量PBS吹打懸浮細胞，然后1 000 r/min離心5 min，盡量去除上清液，將其沉淀重新懸浮于5 ml的NSC增殖培養(yǎng)基中(DMEM/F12培養(yǎng)基，加入2% B27補充劑、20 ng/ml EGF和20 ng/ml FGF以及1%青/鏈霉素溶液)。將細胞以1×105/ml的密度接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中。然后將細胞放在37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，直至第7天，當NSCs增殖形成懸浮球，進行傳代。

1.3NSCs體外分化實驗將預先滅菌的細胞爬片置于6孔細胞培養(yǎng)板中，用1%多聚賴氨酸包被60 min，吸去多余的多聚賴氨酸，蒸餾水洗2遍每次5 min，將包被好的細胞爬片，連同6孔細胞培養(yǎng)板放在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中晾干，選取生長狀況良好的2代或者3代細胞進行下一步的實驗，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用不含EDTA的胰酶將細胞消化1 min，用2 ml含10% FBS的DMEM/F12終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，吹散細胞，將細胞用增殖培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，待細胞完全貼壁，吸去培養(yǎng)液，重新加入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分為3組：BMP4組(分化培養(yǎng)基為DMEM/F12基礎培養(yǎng)液，添加20 ng/ml BMP4蛋白以及1%青/鏈霉素溶液)、BMP4+Noggin組(分化培養(yǎng)基為DMEM/F12基礎培養(yǎng)液，添加20 ng/ml BMP4蛋白以及200 ng/ml Noggin蛋白以及1%青/鏈霉素溶液)、Control組(分化培養(yǎng)基為DMEM/F12基礎培養(yǎng)液以及1%青/鏈霉素溶液)，待到分化第7天進行下一步實驗。

1.4NSCs分化的鑒定取爬片7 d后分化狀態(tài)良好的細胞，吸出培養(yǎng)基，沿培養(yǎng)板側壁輕輕加入適量PBS清洗2次,每次5 min(為了防止細胞被吹離爬片以后每步加液均按此步驟進行)，用經(jīng)預熱的4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS洗3次，每次5 min，用預先配好的0.3% Triton X-100，洗1次、5 min，TBS清洗1次、5 min，PBS清洗2次，每次5 min，5%BSA在37 ℃溫箱孵育封閉1 h，盡量吸去多余的BSA，孵育1抗，兔抗鼠GFAP 1 ∶1 000，4 ℃濕盒內孵育過夜，第2天取出在室溫下放置40 min，TBS洗1次、5 min，PBS洗3次，每次5 min。加二抗:山羊抗兔IgG-Cy3(1 ∶100)；室溫下，避光孵育1 h，以后操作都在避光下進行，TBS洗1次，PBS洗2次,每次5 min，用Dapi染核10 min，PBS洗3次，每次5 min。用吸水紙吸光玻片周圍水使玻片干燥，加抗熒光淬滅劑封片，4 ℃避光保存，熒光顯微鏡(日本尼康80i)拍照。

1.5Westernblot檢測將 NSCs接種在經(jīng)0.1%多聚賴氨酸包被的玻片上，其中BMP組加入20 ng/ml BMP4，BMP4+Noggin組加入20 ng/ml BMP4和200 ng/ml Noggin，Control組加入等量的PBS，貼壁培養(yǎng)7 d。提取各組細胞分化后的總蛋白，用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定各組蛋白含量，確定電泳上樣量為20 μg， 蛋白行10% SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF轉膜，非特異性封閉。加入一抗pSmad1/5/8、Id2兔多抗，所使用抗體稀釋濃度為GAPDH(鼠單抗，1 ∶1 000)、GFAP(兔多抗，1 ∶1 000)、pSmad1/5/8(兔多抗，1 ∶500)、Id2(兔多抗，1 ∶1 000)。4 ℃ 冰箱內孵育過夜，加入對應的二抗; 4 ℃孵育1 h，用ECL發(fā)光劑時間為5 min，通過進行曝光、顯影、定影一系列操作后使用數(shù)碼分析成像軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析，用目的蛋白的灰度值表示相對表達的目的蛋白水平。

1.6細胞計數(shù)熒光顯微鏡用于檢查免疫染色的細胞。 為了確定表達GFAP的細胞數(shù)量，由未參與該項試驗，并且熟悉統(tǒng)計學方法的人員，隨機選擇每個玻片的20個視野進行細胞計數(shù)。 結果表示為GFAP陽性細胞(星形膠質細胞)數(shù)量相對于DAPI陽性細胞總數(shù)的百分比。

2 結果

2.1BMP4對NSCs分化的影響用GFAP進行特異性熒光免疫染色，鑒定不同分組星形膠質細胞的分化，紅色為GFAP特異性標記星形膠質細胞(圖1A)。細胞計數(shù)檢測GFAP陽性細胞的表達，與Control組(陽性率64.9%±2.04%)相比，BMP4組(陽性率94.6%±1.49%)的GFAP表達顯著增加。與BMP4組相比，BMP4+Noggin組(陽性率31.6%±1.21%)中表達GFAP的細胞的陽性率顯著降低(F=381.1，P<0.01)(圖1B)。同時用Western blot檢測GFAP蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)與Control組相比，BMP4組的蛋白表達明顯升高；與BMP4組相比，BMP4+Noggin組的蛋白表達明顯減少(F=126.2，P<0.01)，見圖2。

2.2BMP4對pSmad1/5/8蛋白表達的影響用蛋白質免疫印跡技術檢測分化7 d的Control組、BMP4組和BMP4+Noggin組中pSmad1/5/8蛋白的表達。發(fā)現(xiàn)BMP4組中pSmad1/5/8的表達顯著高于對照組和BMP+Noggin組(F=2 149，P<0.01)，見圖3。

圖1不同分化條件下NSCs免疫熒光GFAP陽性表達

A：星形膠質細胞的免疫熒光染色鑒定 ×200；紅色：GFAP標記星形膠質細胞；藍色：Dapi標記細胞核；合成：將細胞與細胞核進行融合；B：NSCs分化為星形膠質細胞的陽性率表達比較；與Control組比較：**P<0.01；與BMP4+Noggin組比較：##P<0.01

圖2 NSCs分化后GFAP蛋白表達量的比較

與Control組比較：**P<0.01；與BMP4+Noggin組比較：##P<0.01

圖3 NSCs分化后pSmad1/5/8蛋白表達量的比較

與Control組比較：**P<0.01；與BMP4+Noggin組比較：##P<0.01

2.3BMP4對Id2蛋白表達的影響通過Western blot 檢測不同分組中Id2蛋白的表達水平。 BMP4組Id2蛋白的表達顯著高于Control組和BMP4+Noggin組(F=978.9，P<0.01)，見圖4。

圖4 NSCs分化后Id2蛋白表達量的比較

與Control組比較：**P<0.01；與BMP4+Noggin組比較：##P<0.01

3 討論

本實驗檢測了BMP信號通路中pSmad1/5/8及其下游Id2蛋白的表達，同時用星形膠質特異性抗體、GFAP進行免疫熒光染色，檢測星形膠質細胞的表達。證實了BMP4在NSCs分化過程中通過上調Id2的表達，促進了星形膠質細胞的分化。

BMP是信號傳導配體轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的成員。其通過信號轉導進入細胞核進行轉錄調控，BMP在神經(jīng)發(fā)生和星形膠質發(fā)生過程中起著動態(tài)的作用[4]。BMP4作為BMPs家族中重要的一員，在體內外的實驗中被證實可以抑制NSCs向神經(jīng)功能細胞分化，抑制了神經(jīng)功能的恢復[3]，研究[6]顯示，BMP的應用可以減少NSCs向少突膠質細胞的分化，并促進其向星形膠質細胞的分化。這與本研究結果BMP4增加NSCs分化中星形膠質細胞的表達是一致的。然而BMP是通過何種途徑增加星形膠質細胞的分化，其具體機制并不十分清楚，因此探索其可能的分子機制十分必要，這也是本實驗重點。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白通過BMP信號通路和信號通路下游受體(Smad1/5/8)發(fā)揮生物學作用，其中受體的磷酸化發(fā)揮著不可或缺的作用，當BMP信號通路激活，其使下游受體Smad1/5/8磷酸化，同時磷酸化的Smad1/5/8(pSmad1/5/8)可以進入細胞核內調控目的基因的轉錄。本研究通過免疫熒光染色檢測星形膠質的細胞表達，以及Western blot檢測GFAP蛋白和pSmad1/5/8蛋白的表達，結果表明BMP4的應用可以促進NSCs分化為星形膠質細胞，同時pSmad1/5/8蛋白表達增加，加入BMP受體拮抗劑Noggin后，隨著pSmad1/5/8的表達減少，GFAP表達顯著降低。此結果與其他研究的結果一致，因此認為BMP4可以通過BMP-Smad1/5/8信號通路促進了星形膠質細胞的分化[7]，初步探索了其可能的分子機制。

Id家族是細胞命運的重要調節(jié)因子，包括增殖、分化和凋亡，Id蛋白的高表達可以抑制神經(jīng)元的分化，促進星形膠質細胞的分化[8]。Id2是Id家族中最重要的成員之一，在調節(jié)細胞增殖和維持細胞多樣性和分化方面起著至關重要的作用[9]。 研究[10]表明，在SCI早期，Id蛋白的表達顯著增加，這與損傷后BMP表達的增加是相一致的，同時Id蛋白的高表達促進了損傷部位星形膠質細胞的分化。有研究[11]表明BMP2可以上調下游基因Id2的表達，促進少突膠質前體細胞向星形膠質細胞的分化，同時抑制了這些細胞分化為少突膠質細胞。因此推測BMP使體外培養(yǎng)的NSCs星形膠質細胞分化增多，是由Id蛋白表達增加介導的。為了探索Id蛋白在NSCs分化過程中的作用，本研究通過Western blot檢測不同組中Id2蛋白的表達。發(fā)現(xiàn)隨著BMP信號通路的激活，Id2蛋白表達增加。然而使用Noggin抑制BMP信號通路時，Id2的表達顯著減少。因此BMP4可以通過BMP-Smad1/5/8信號通路調節(jié)Id2基因的表達，這相關研究[12]結果是一致的。本實驗證實BMP4能夠通過BMP-Smad1/5/8信號通路上調Id2的表達，促進NSCs分化為星形膠質細胞，同時確定了Id基因在NSCs分化中的作用。

綜上所述，本實驗通過NSCs體外分化證實了BMPs可以激活BMP-Smad1/5/8信號通路上調Id2的表達，從而促進星形膠質細胞的分化，確定了其可能的分子機制。本實驗的結果為如何調控SCI后星形膠質細胞的分化進而調控膠質瘢痕大小提供了新的思路。本研究的局限性是沒有進行動物實驗來進一步證實本實驗的結論，這將是下一個研究重點。