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人骨形成蛋白7對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖和分化的作用研究

2018-11-07 05:38蔣玉清劉文釗蘇玲瑜
關(guān)鍵詞:牙本質(zhì)牙髓礦化

喻 剛,蔣玉清,劉文釗,蘇玲瑜

人牙髓細(xì)胞(human dental pulp cells,hDPCs)的主要成分是牙髓成纖維細(xì)胞和少量未分化的間充質(zhì)細(xì)胞,其中,未分化的間充質(zhì)細(xì)胞具有多向分化的潛能,在一定條件下可以向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化,這對(duì)于牙髓組織的損傷修復(fù)意義重大[1-2]。人骨形成蛋白(human bone morphogenetic proteins,BMPs)在牙齒發(fā)育和牙髓損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。有研究[3]顯示,在動(dòng)物體內(nèi),采用BMP-7(又名成骨蛋白1)與膠原載體復(fù)合用于牙齒的直接蓋髓治療,在蓋髓部位可見修復(fù)性牙本質(zhì)形成,表明BMP-7是牙髓修復(fù)的潛在治療因子。該研究通過觀察BMP-7對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖和分化的影響,探討B(tài)MP-7在人牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體損傷修復(fù)中的具體作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑 BMP-7購自美國Peprotech公司;DMEM低糖培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gibco公司;胰酶、MTT購自Sigma公司;EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司;RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;礦化誘導(dǎo)液購自Biosharp公司;茜素紅染液和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)檢測(cè)試劑盒購自西安赫特生物科技有限公司;波形絲蛋白(Vimentin)和角蛋白(Keratin)抗體購自英國Abcam公司;FITC標(biāo)記的熒光二抗購自武漢博士德生物工程有限公司;cDNA合成試劑盒和qRT-PCR試劑盒均購自美國BIO-RAD公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 Heraeus BB15型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國ThermoFisher公司);BHC-1000IIA/B3型生物安全柜(中國蘇凈安泰生物技術(shù)有限公司);Sorvall ST16型低速離心機(jī)(美國ThermoFisher公司);IX73型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);Multiscan MK3酶標(biāo)儀(美國ThermoFisher公司);ABI7500型熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1人牙髓細(xì)胞的收集與原代培養(yǎng) 收集臨床因正畸或阻生拔除的健康前磨牙(30歲以下,無牙體及牙周疾病),于無菌條件下用含有雙抗的低糖無血清DMEM培養(yǎng)液浸泡并沖洗數(shù)遍,劈開牙冠取出牙髓組織,立即用培養(yǎng)基沖洗3遍并充分剪碎,加入2.5 g/L胰酶于37 ℃消化1 h,加入等量含血清培養(yǎng)基終止消化,1 000 r/min離心3 min收集細(xì)胞,采用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸并接種細(xì)胞,置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2~3 d換液一次,待細(xì)胞融合率達(dá)80%后消化并按1 ∶2傳代培養(yǎng)。取2~5代的hDPCs進(jìn)行Vimentin和Keratin免疫熒光檢測(cè)鑒定,并開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2EdU細(xì)胞增殖檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長期的hDPCs并接種于96孔板中,次日,向孔中加入終濃度為50、100和200 ng/ml 的BMP-7處理細(xì)胞,每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)置溶劑對(duì)照組。將EdU加入各處理組共同孵育36 h以標(biāo)記增殖細(xì)胞,按試劑盒操作說明對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定染色,在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 收集對(duì)數(shù)生長期的hDPCs并接種于96孔板中,次日,采用1.2.2項(xiàng)下的方法處理細(xì)胞。于處理1、3、7、10 d行MTT檢測(cè):向每孔加入20 μl MTT溶液(5 g/L),在37 ℃孵育2~4 h,再加入50 μl 質(zhì)量濃度為200 g/L的酸性SDS溶液,于37 ℃溶解甲臜過夜,最后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長下的吸光度值。

1.2.4礦化結(jié)節(jié)檢測(cè) 收集2~5代的hDPCs并接種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后向孔中加入含50、100、200 ng/ml BMP-7的礦化誘導(dǎo)液(含10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 g/L 維生素C的DMEM培養(yǎng)基)處理細(xì)胞,每3 d更換一次誘導(dǎo)液。于處理后的第10天吸出誘導(dǎo)液,采用PBS洗3次,甲醇固定15 min,PBS洗2次,加入茜素紅染液于37 ℃染色30 min,PBS洗3次,在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5堿性磷酸酶活性檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長期的hDPCs并接種于24孔板中,采用1.2.4項(xiàng)下的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞。分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)后第1、3、7、10天棄去誘導(dǎo)液并裂解細(xì)胞,按堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行相應(yīng)處理,并檢測(cè)405 nm波長下的吸光度值。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR 收集對(duì)數(shù)生長期的hDPCs并接種于6孔板中,采用1.2.4項(xiàng)下的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞,并于誘導(dǎo)培養(yǎng)后第10天進(jìn)行牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(dentin matrix protein 1,DMP-1)和牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)mRNA表達(dá)水平的測(cè)定:按試劑盒操作說明提取hDPCs總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。使用的引物序列如下:DMP-1(forward):5′-GTGAGTGAGTCCAGGGGAGATAA-3′,DMP-1(reverse):5′-TTTTGAGTGGGAGAGTGTGTGC-3′;DSPP(forward):5′-CTGTTGGGAAGAGCCAAGATAAG-3′,DSPP(reve-rse):5′-CCAAGATCATTCCATGTTGTCCT-3′;GAPDH(forward):5′-CAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3′,GAPDH(reverse):5′-CCAAATTCGTTGTCATACCA-3′。以GAPDH mRNA表達(dá)水平作為內(nèi)參,通過檢測(cè)目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)變化進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1hDPCs細(xì)胞來源鑒定細(xì)胞免疫熒光的檢測(cè)結(jié)果顯示,原代培養(yǎng)的hDPCs細(xì)胞Vimentin檢測(cè)結(jié)果為陽性,胞質(zhì)內(nèi)可見明顯的綠色熒光,而Keratin檢測(cè)呈陰性(圖1)。該結(jié)果表明原代培養(yǎng)的hDPCs來源于中胚層的間充質(zhì)細(xì)胞。

2.2BMP-7對(duì)hDPCs增殖的影響如圖2A和2B所示,采用不同濃度的BMP-7(50、100和200 ng/ml)處理hDPCs后,對(duì)照組和BMP-7處理組hDPCs中紅色標(biāo)記的增殖細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;此外,MTT細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果也顯示,采用BMP-處理細(xì)胞1、3、7、10 d后,各時(shí)間點(diǎn)的BMP-7處理組與對(duì)照組相比,hDPCs細(xì)胞生長活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),不同濃度BMP-7處理組之間細(xì)胞活力也無明顯差異(圖2C)。結(jié)果表明,BMP-7對(duì)hDPCs增殖無明顯影響。

圖1 細(xì)胞免疫熒光鑒定hDPCs 細(xì)胞免疫熒光×200

圖2 不同濃度BMP-7對(duì)hDPCs增殖的影響 EdU染色×100

圖3 不同濃度BMP-7誘導(dǎo)hDPCs礦化結(jié)節(jié)形成情況 茜素紅染色×100

2.3BMP-7對(duì)hDPCs鈣化結(jié)節(jié)形成的影響采用含不同濃度BMP-7的礦化誘導(dǎo)液(BMP-7濃度分別為50、100和200 ng/ml)處理hDPCs 10 d后,BMP-7處理組茜素紅染色均呈陽性,可見明顯的礦化結(jié)節(jié),且礦化結(jié)節(jié)的量隨BMP-7濃度的升高而增多(圖3)。

2.4BMP-7對(duì)hDPCsALP活性的影響采用含不同濃度BMP-7的礦化誘導(dǎo)液處理hDPCs 3、7、10 d后,BMP-7處理組ALP活性值顯著高于對(duì)照組(P<0.01),且在同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi),ALP的活性隨著BMP-7濃度的升高而顯著增強(qiáng);隨著作用時(shí)間的延長,各處理組ALP的活性也有明顯提升(表1)。

表1 各時(shí)間點(diǎn)不同濃度的BMP-7處理組在405 nm處的吸光度值(n=3)

2.5BMP-7對(duì)成牙本質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響采用不同濃度的BMP-7礦化誘導(dǎo)液處理hDPCs 10 d后,各BMP-7處理組DMP-1和DSPP mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),且隨著BMP-7濃度的升高,兩種基因的表達(dá)水平也有顯著提升(圖4)。

圖4 BMP-7對(duì)成牙本質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

BMP-7屬于TGF-β細(xì)胞因子超家族中骨形成蛋白亞家族,又稱為成骨蛋白1,具有多種生物學(xué)功能。有研究[4]顯示,BMP -7是一種重要的腎臟調(diào)節(jié)因子,與腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸密切相關(guān),對(duì)維持腎臟的正常結(jié)構(gòu)和功能也有重要意義。此外,BMP-7還具有抑制器官纖維化的作用[5-6],還可用于誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化[7]。而作為一種重要的成骨誘導(dǎo)因子,其主要功能則在促進(jìn)骨骼的發(fā)育和損傷修復(fù)方面,諸多實(shí)驗(yàn)和臨床研究[8]表明,BMP-7能促進(jìn)骨折愈合,并已在臨床上用于多種骨科疾病的治療。同時(shí),在牙髓生物學(xué)領(lǐng)域,BMP-7在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和第三期牙本質(zhì)的形成中具有重要的作用,并能誘導(dǎo)牙乳頭細(xì)胞發(fā)生功能性分化[3]。林正梅 等[9]采用重組腺病毒介導(dǎo)hBMP-7基因轉(zhuǎn)染人牙髓細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)與空載體組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組相比,hBMP-7基因轉(zhuǎn)染組檢測(cè)到了牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化,表明BMP-7在牙髓的損傷修復(fù)中也具有重要的調(diào)控作用。由此可見,BMP-7在保髓治療中也具有很大的應(yīng)用前景。

本研究直接采用BMP-7因子處理人牙髓細(xì)胞,并運(yùn)用多種評(píng)價(jià)指標(biāo)檢測(cè)BMP-7在誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞增殖及分化中的作用。其中,ALP是評(píng)價(jià)牙髓細(xì)胞早期分化的重要標(biāo)志物。當(dāng)牙髓中的未分化間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化時(shí),ALP活性顯著提升。DMP-1在牙本質(zhì)形成和礦化過程中具有重要作用,它的表達(dá)水平可以提示牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的程度。DSPP是牙本質(zhì)非膠原蛋白的主要成分,可以作為成牙本質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記蛋白。結(jié)果顯示,經(jīng)BMP-7處理的hDPCs,細(xì)胞增殖無顯著變化,但可形成明顯的礦化結(jié)節(jié),且ALP活性呈劑量和時(shí)間依賴性地增加,DMP-1和DSPP的表達(dá)水平也較對(duì)照組顯著提升,進(jìn)一步證實(shí)了BMP-7可以誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。

BMPs家族蛋白發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的分子機(jī)制涉及兩條重要的信號(hào)通路:Smads介導(dǎo)的信號(hào)通路和MAPK途徑。前者是由靶細(xì)胞膜上BMPs受體及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)各型Smads蛋白協(xié)同參與完成,是TGF-β超家族包括BMPs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的經(jīng)典通路;后者屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,主要在Smads途徑被阻斷后,作為補(bǔ)救途徑來介導(dǎo)BMPs信號(hào)的傳遞[10]。大量研究顯示,BMPs誘導(dǎo)的牙髓細(xì)胞分化與兩種信號(hào)通路均有關(guān)聯(lián)。Qin et al[11]的研究顯示,在誘導(dǎo)向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的過程中,BMP-2的加入促進(jìn)了Smad1/5磷酸化,而采用BMP信號(hào)抑制劑Noggin選擇性抑制Smad蛋白活性,則可顯著抑制牙髓細(xì)胞的分化,表明Smad1/5在其中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。Yang et al[12]的研究則發(fā)現(xiàn),BMP-2通過刺激p38 MAPK信號(hào)通路,激活了調(diào)控干細(xì)胞生長的WNT/ β-catenin信號(hào),這一信號(hào)級(jí)聯(lián)也是調(diào)控牙髓細(xì)胞分化的主要分子機(jī)制。此外, Li et al[13]的研究也表明MAPK通路參與了BMP-9誘導(dǎo)牙囊干細(xì)胞分化的調(diào)控。由此我們推斷,BMP-7誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化也可能受到了Smads信號(hào)通路和MAPK途徑的調(diào)控。

綜上所述,BMP-7可誘導(dǎo)hDPCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化,而對(duì)hDPCs增殖無顯著影響,其誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞分化的作用機(jī)制可能與BMPs/Smads和MAPK信號(hào)通路的調(diào)控相關(guān),具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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