黃媛媛，李 靜，李忠穩(wěn)，夏先明

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC) 是一種腸道疾病，病理特征是炎癥反應(yīng)和黏膜損害。過度的炎癥反應(yīng)破壞了腸上皮細(xì)胞層的完整性，導(dǎo)致黏膜潰瘍[1]。TJs蛋白差異表達(dá)導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間結(jié)構(gòu)松散或形態(tài)變化是UC患者腸黏膜屏障功能降低的主要原因[2]。研究[3]證明，緊密連接(tight junctions，TJs)蛋白的磷酸化會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞的極性改變和結(jié)構(gòu)變化，從而影響上皮屏障功能。TJs蛋白的磷酸化狀態(tài)受酪氨酸激酶和絲氨酸-蘇氨酸激酶的調(diào)節(jié)。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是酪氨酸激酶家族中最重要的激酶，通過其配體表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)的激活，可以調(diào)節(jié)TJs蛋白的差異表達(dá)和磷酸化狀態(tài)[4]。該研究觀察T84結(jié)腸細(xì)胞中TJs蛋白的磷酸化狀況，以及EGF對(duì)TJs蛋白磷酸化的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料T84結(jié)腸細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞中心；小鼠抗claudin-1抗體、小鼠抗claudin-5抗體、兔抗claudin-3抗體、兔抗claudin-7抗體、兔抗occludin抗體、兔抗Zo-1抗體、DMEM/F12培養(yǎng)基等購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；EGF購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗claudin-3(磷酸化位點(diǎn)Tyr219)抗體、兔抗claudin-5(磷酸化位點(diǎn)Tyr217)抗體、兔抗claudin-7(磷酸化位點(diǎn)Tyr210)抗體等購(gòu)自美國(guó)Assay Biotechnology公司；兔抗β-tubulin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司；辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗購(gòu)自上?？党缮锕?；化學(xué)發(fā)光HRP底物購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)T84細(xì)胞傳至8～10代使用。以含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，加入100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，在37 ℃、5% CO2、90%相對(duì)濕度的環(huán)境中培養(yǎng)。T84細(xì)胞培養(yǎng)至單層融合狀態(tài)，然后在對(duì)照組培養(yǎng)基中加入DMSO (EGF溶劑，100 ng/ml)，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入EGF (100 ng/ml)。在干預(yù)后24、48、72 h進(jìn)行細(xì)胞遷移檢測(cè)或收集T84細(xì)胞，用于TJs蛋白的Western blot檢測(cè)。

1.3Westernblot檢測(cè)從每個(gè)樣品中取出20 μg總蛋白，通過4%～20% SDS-PAGE電泳分離，并使用半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad)轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜在封閉溶液封閉2 h，加適當(dāng)比例稀釋的一抗孵育過夜?？贵w稀釋濃度：小鼠抗claudin-1抗體、小鼠抗claudin-5抗體、兔抗claudin-3抗體、兔抗claudin-7抗體、兔抗occludin抗體、兔抗Zo-1抗體、兔抗claudin-3磷酸化抗體、兔抗claudin-5磷酸化抗體，以及兔抗claudin-7磷酸化抗體、兔抗β-tubulin抗體等均以1 ∶200比例來稀釋。以PBST洗滌PVDF膜4次。每次15 min，再加辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗，稀釋比例1︰1 000。最后將免疫復(fù)合物用辣根過氧化物酶底物的化學(xué)發(fā)光劑來顯影，拍照留存。

1.4細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)使用劃痕的方法來評(píng)價(jià)EGF對(duì)細(xì)胞遷移的影響。T84細(xì)胞培養(yǎng)至單層融合狀態(tài)，并在DMEM/F12(不含胎牛血清)培養(yǎng)基中過夜。用無菌的20 μl加樣槍頭在細(xì)胞中央劃痕，再用DMEM/F12洗去漂浮的細(xì)胞。劃痕后的對(duì)照組培養(yǎng)基中加入DMSO(100 ng/ml)，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入EGF(100 ng/ml)。分別于干預(yù)后24 h和48 h，在相同的位置用倒置顯微鏡(型號(hào)IX71，日本奧林巴斯公司)拍照，評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移的速度[5]。

2 結(jié)果

2.1EGF對(duì)T84細(xì)胞TJs蛋白的表達(dá)和磷酸化的影響與對(duì)照組比較，EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后磷酸化claudin-3水平明顯下降(t=7.024，P<0.05)，非磷酸化claudin-3水平升高(t=-6.874，P<0.05)；EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在24 h和72 h后，非磷酸化claudin-3及磷酸化claudin-3與對(duì)照組比較均無明顯變化。見圖1。與對(duì)照組比較，EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后磷酸化claudin-5水平升高(t=-13.115，P<0.05)，非磷酸化claudin-5水平在72 h后明顯下降(t=5.356，P<0.05)；EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在24 h后，非磷酸化claudin-5及磷酸化claudin-5與對(duì)照組比較均無明顯變化。見圖2。與對(duì)照組比較，EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后磷酸化claudin-7水平升高(t=-7.116，P<0.05)，非磷酸化claudin-7水平?jīng)]有變化；EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在24 h和72 h后，非磷酸化claudin-7及磷酸化claudin-7與對(duì)照組比較均無明顯變化。見圖3。與對(duì)照組比較，EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后非磷酸化claudin-1水平升高(t=-10.337，P<0.05)；非磷酸化occludin水平在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比均無變化；非磷酸化Zo-1水平在EGF干預(yù)24 h后高于對(duì)照組(t=-10.337，P<0.05)，48 h后與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，72 h后有所下降(t=-10.987，P<0.05)。見圖4。

2.2EGF對(duì)T84結(jié)腸細(xì)胞遷移的影響劃痕后24 h，EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞和對(duì)照組的遷移率分別為(37.48±3.82)%和(21.37±2.35)%，EGF干預(yù)組遷移率高于對(duì)照組(t=-8.831，P<0.05)，這一趨勢(shì)在48 h后更為明顯，EGF干預(yù)組和對(duì)照組遷移率分別為(50.35±5.43)%和(23.83±2.63)%(t=-11.105，P<0.05)。見圖5。

圖1 Western blot檢測(cè)EGF對(duì)T84 結(jié)腸細(xì)胞中claudin-3蛋白磷酸化的影響

圖2 Western blot 檢測(cè)EGF對(duì)T84 結(jié)腸細(xì)胞中claudin-5蛋白磷酸化的影響

圖3 Western blot 檢測(cè)EGF對(duì)T84 結(jié)腸細(xì)胞中claudin-7蛋白磷酸化的影響

圖4 Western blot 檢測(cè)EGF對(duì)T84 結(jié)腸細(xì)胞中claudin-1、occludin、Zo-1蛋白表達(dá)的影響

圖5 EGF 對(duì)T84 結(jié)腸細(xì)胞損傷/修復(fù)的影響 ×100

3 討論

TJs位于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的頂層結(jié)構(gòu)中，形成一個(gè)生理性屏障來調(diào)節(jié)各種溶質(zhì)經(jīng)細(xì)胞旁的滲透。TJs蛋白包括claudin亞型、occludin和Zo亞型，是細(xì)胞主要的跨膜蛋白，相互之間形成連續(xù)的緊密連接束，并以組織特異性的方式相互作用，在上皮細(xì)胞間形成電荷和孔道選擇性屏障[6]。文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型中，可出現(xiàn)claudin亞型、occludin和Zo亞型的表達(dá)下調(diào)，并且這種效應(yīng)常伴有腸上皮層通透性的增加，以及上皮屏障功能的受損。研究[9]表明，蛋白的翻譯后修飾異常與疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，TJs蛋白的翻譯后修飾包括棕櫚化、O-糖基化和磷酸化。TJs蛋白的磷酸化是調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞層通透性的重要方法。

某些TJs蛋白亞型適度的磷酸化是維持其生理功能所必須的；不過，TJs蛋白異常磷酸化會(huì)改變其彼此間的結(jié)合方式，從而影響TJs的聚集和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使跨上皮細(xì)胞層電阻和上皮細(xì)胞間通透性發(fā)生變化，最終影響到上皮屏障的功能[10]。蛋白激酶C誘導(dǎo)的磷酸化使claudin-3參與裝配TJs的位點(diǎn)減少，導(dǎo)致TJs強(qiáng)度的下降[11]。claudin-5的酪氨酸磷酸化與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞層的通透性增加有關(guān)，使單核細(xì)胞更容易通過損傷的血腦屏障[12]。在腎上皮細(xì)胞系，claudin-7磷酸化水平的升高與細(xì)胞間氯離子通透性增加有關(guān)[13]。TJs蛋白在UC時(shí)的磷酸化狀態(tài)至今未有文獻(xiàn)報(bào)道。

Guntaka et al[14]發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)了膽管上皮細(xì)胞claudin-3的磷酸化，伴隨TJs結(jié)構(gòu)破壞和上皮屏障功能損傷，應(yīng)用EGF可以降低claudin-3水平磷酸化，修復(fù)膽管上皮屏障。本研究顯示，EGF影響了腸上皮細(xì)胞TJs蛋白的表達(dá)及磷酸化。與對(duì)照組比較，EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后磷酸化claudin-3水平明顯下降，非磷酸化claudin-3水平升高，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。此外，EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后磷酸化claudin-5、claudin-7水平升高，72 h后非磷酸化claudin-5水平明顯下降，非磷酸化claudin-7水平?jīng)]有變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EGF 可以調(diào)節(jié)claudin亞型的磷酸化水平。文獻(xiàn)[15]報(bào)道中樞血管內(nèi)皮細(xì)胞中claudin-5、claudin-7的磷酸化與內(nèi)皮屏障功能受損有關(guān)，而本試驗(yàn)未曾探討病理狀態(tài)下T84細(xì)胞中TJs蛋白的磷酸化狀況，僅提示EGF 可以調(diào)節(jié)提高claudin-5、claudin-7的磷酸化水平，其臨床意義有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

本試驗(yàn)還觀察到，EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后非磷酸化claudin-1水平升高，非磷酸化occludin水平在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比均無變化，而非磷酸化Zo-1水平在EGF干預(yù)24 h后即升高，48 h后與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，72 h后有所下降。以上結(jié)果表明EGF可以調(diào)節(jié)TJs蛋白的表達(dá)。EGF還對(duì)細(xì)胞劃痕/修復(fù)有一定作用，表現(xiàn)為EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞遷移率明顯高于對(duì)照組，提示EGF可能有助于腸黏膜損傷的修復(fù)，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致。TJs蛋白的磷酸化使得其參與裝配TJs的位點(diǎn)減少[11]，因而細(xì)胞間連接功能減弱，細(xì)胞遷移功能增強(qiáng)；本研究顯示EGF改變了細(xì)胞claudin蛋白的磷酸化狀態(tài)，同時(shí)促進(jìn)了上皮細(xì)胞的遷移，提示EGF介導(dǎo)的TJs蛋白磷酸化有助于上皮細(xì)胞的損傷后修復(fù)。

綜上所述，EGF可以影響腸上皮細(xì)胞間TJs蛋白的表達(dá)和磷酸化狀態(tài)，并促進(jìn)損傷上皮細(xì)胞的修復(fù)。EGF對(duì)UC的治療作用是否與此有關(guān)，以及其具體機(jī)制，有待進(jìn)一步探討。