王 兵，顏琳琳，關江鋒，胡作為，王 珊，侯 煒

惡性胸腔積液(malignant pleural effusion，MPE)是肺癌常見的并發(fā)癥之一[1]。可以導致患者胸悶、氣促、咳嗽、胸痛、呼吸困難，影響心肺功能，加快腫瘤擴散，嚴重時可危及生命。據(jù)統(tǒng)計肺腺癌MPE患者的中位總生存期僅為14.3～21.4個月[2]。臨床上惡性腫瘤一旦合并胸腔積液，就意味著病變已局部或全身擴散，預后極差，是手術不能治愈的晚期疾病標志，此時治療的主要目的是有效地控制胸腔積液，緩解臨床癥狀，提高生活質量，延長生存期。中醫(yī)藥以其獨特的優(yōu)勢，在MPE的治療中逐漸發(fā)揮了重要作用，近年來許多學者進行了大量中醫(yī)藥治療MPE的臨床研究[3-4]，表明中醫(yī)藥在治療MPE方面確實具有一定優(yōu)勢，但是有關作用機制研究卻較少開展。

中藥消水方是中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院腫瘤科沿用多年的經(jīng)驗方，前期臨床研究顯示中藥消水方口服聯(lián)合順鉑胸腔灌注治療MPE 65例，有效率達72.3%，并能明顯緩解臨床癥狀，提高免疫功能，延長生存時間[5-6]。水通道蛋白(aquqporin，AQPs)是近年來發(fā)現(xiàn)的在機體水液代謝中起著重要作用的跨膜轉運蛋白[7]，到目前為止共發(fā)現(xiàn)13個亞型，AQP 0～12存在于人體的多個組織器官[8]，研究[9-10]顯示AQP1在小鼠胸膜間皮細胞上廣泛表達，且在MPE的產(chǎn)生中也發(fā)揮了重要作用。因此推測消水方可能通過影響AQP1表達從而發(fā)揮抑制MPE的作用, 該研究通過建立小鼠肺癌MPE模型，采用消水方干預后檢測胸膜AQP1表達，深入探討中藥抑制MPE的可能機制。

1 材料與方法

1.1動物及細胞株SPF級6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，(20±2)g，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所提供，許可證號：SCXK(京)2004-0001。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院清潔級動物中心，許可證號：SYXK(京)2005-0001。所有動物在進行實驗前均環(huán)境適應性飼養(yǎng)1周以上。帶有熒光標記的小鼠Lewis肺癌細胞株(C57BL/6來源)由美國國立癌癥研究所惠贈。

1.2藥物中藥消水方組成：葶藶子30 g，生黃芪15 g，刺五加15 g，醋莪術10 g，炒白術15 g，黃芩10 g，大棗15 g，全瓜蔞15 g，徐長卿15 g，半枝蓮30 g，車前子30 g，茯苓15 g等。各藥物均由中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院中藥房提供，并經(jīng)該院藥劑科王麗霞主任藥師鑒定為正品。分別5、2.5倍水量煎煮2次，混合過濾，蒸發(fā)濃縮制成1 g生藥/ml藥液于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑熒光素酶底物D-Luciferin購自冷泉港生物科技股份有限公司；異氟烷購自河北九派制藥有限公司；TRIzol Reagent、UltraPure Agarose、High Capacity RNA-to-cDNA Kit、TapMan Gene Expression Master Mix、TaqMan Gene Expression Assays均購自美國Life Technologies公司；兔抗鼠AQP1抗體、β-actin內參抗體均購自美國Abcam公司；山羊抗兔IgG-HRP、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、PVDF膜、BeyoECL Plus均購自江蘇碧云天生物技術研究所。

1.4主要儀器IVIS Lumina II小動物活體成像系統(tǒng)購自美國Caliper公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計購自美國Thermo Scientific公司；Progene PCR 擴增儀購自英國Techene公司；Applied Biosystems 7500 Fast實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；水平電泳槽、垂直電泳槽、電轉移槽、電泳儀、Bio-Rad ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀購自北京六一儀器廠；Synergy HT型酶標儀購自美國Biotek公司；3-30K型高速冷凍離心機購自美國Sigma公司；TS100型光學倒置顯微鏡購自日本Nikon公司；MCO-18AIC CO2細胞培養(yǎng)箱購自日本Sanyo公司。

1.5方法

1.5.1小鼠肺癌胸腔積液模型建立及實驗分組 小鼠肺癌胸腔積液模型參照文獻[11-12]方法并加以改良：Lewis肺癌細胞復蘇后加入培養(yǎng)液置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，收集處于對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細胞，加入PBS緩沖液調整細胞終濃度為2.5×106/ml。接種前用75%酒精消毒小鼠胸部右側皮膚，用1 ml注射器吸取細胞懸液，輕輕搖動使細胞混勻，從小鼠右側胸部靠近腋中線，約平第6肋間隙，針頭向上與胸壁成30°夾角，注射入胸腔，接種量為2.5×106/ml的細胞懸液0.2 ml/鼠?？瞻捉M小鼠于同一位置胸腔內注射相同體積的PBS緩沖液。活體成像可見小鼠胸腔熒光隨著時間推移逐漸增強，并且解剖發(fā)現(xiàn)小鼠右側胸腔存在血性胸水及魚肉色腫瘤結節(jié)即為造模成功。取45只C57BL/6小鼠，隨機分為中藥組、模型組、空白組，按照上述方法造模，建模第3天后按如下給藥：中藥組：以33.5 g/(kg·d)生藥藥液，調整至0.2 ml予小鼠灌胃，1次/d；模型組：給予0.2 ml的生理鹽水灌胃，1次/d；空白組：給予0.2 ml的生理鹽水灌胃，1次/d。建模當天為第1天，3 d后即第4天起開始給藥，總共用藥10 d，第14天處死取材。

1.5.2活體成像動態(tài)觀察胸腔熒光變化 三組各隨機選取5只小鼠，分別于第3、8、13天時進行小鼠活體成像觀察。實驗時將熒光素酶底物置于室溫融化，小鼠稱重后，以10 μl底物/1g 鼠濃度計算每只小鼠所需底物體積，然后將相應體積熒光素酶底物注入小鼠腹腔內，35 min后置于小動物活體成像儀器內測量胸腔積液及胸壁熒光值。以腫瘤接種天數(shù)為橫坐標，單位面積熒光值為縱坐標，繪制胸腔積液及移植瘤體內生長曲線。

1.5.3取材并測定胸腔積液體積 給藥觀察期結束后，過量麻醉處死小鼠，仰臥位進行解剖，沿腹中線暴露腹腔，剝離肝臟，暴露橫膈膜，觀察有無胸水形成，沿胸骨中線剪開胸壁，以1 ml注射器抽取雙側胸腔積液并準確記錄其體積。將整個胸壁剪下，固定于解剖板上，手術尖刀切割壁層胸膜，置于-80 ℃冰箱保存用于后續(xù)檢測。

1.5.4RT-PCR檢測壁層胸膜AQP1 mRNA表達 取100 mg壁層胸膜組織，采用TRIzol法，通過勻漿、裂解、分離相、沉淀、洗滌、溶解等步驟提取胸膜中總RNA，使用超微量分光光度計測定RNA的濃度與純度，并進行瓊脂糖凝膠電泳驗證其完整性。配制逆轉錄反應體系，按照實時熒光定量PCR儀操作手冊進行轉錄成 cDNA，然后進行實時熒光定量PCR擴增。檢測基因采用TapMan Gene Expression Assays的預混基因，包括待測基因AQP1(ID：Mm01326466_m1)，內參基因GAPDH(ID：Mm99999915_g1)。將cDNA、待測基因與TapMan Gene Expression Master Mix混勻，轉移至光學反應板上，覆蓋光學反應膜，運行PCR反應程序，導出相對定量數(shù)據(jù)。以相對表達量(2-ΔΔCt)值表示目的基因mRNA表達。

1.5.5Western blot檢測壁層胸膜AQP1蛋白表達 取壁層胸膜組織100 mg，加入RIPA裂解液，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度并調整蛋白濃度一致，取等量蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳，濕轉至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，加AQP1(β-actin作為內參)一抗4 ℃孵育過夜，洗滌，二抗室溫孵育1 h，洗滌，ECL超敏化學發(fā)光法顯色，置于凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity One軟件導出圖片，并對各組條帶光密度值進行分析。相對光密度值=處理組目標蛋白光密度值/處理組內參蛋白光密度值。

2 結果

2.1各組小鼠不同時間胸腔熒光水平空白組小鼠胸腔全程未見熒光出現(xiàn)，中藥組和模型組小鼠在第3天時行活體成像觀察可見兩組熒光強度基本一致，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第8天成像時兩組熒光強度開始表現(xiàn)出一定差異，但也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第13天成像時中藥組熒光強度明顯低于模型組熒光強度，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、2。

2.2各組小鼠胸腔積液量各組小鼠在給藥觀察期內均未見死亡，解剖發(fā)現(xiàn)空白組小鼠胸腔內壁光滑，未發(fā)現(xiàn)胸腔積液及胸壁移植瘤，如圖3A、3B所示。而模型組和中藥組小鼠胸腔均可見油膩性的血性胸腔積液，胸壁上多發(fā)腫瘤結節(jié)，小者呈顆粒樣聚集，大者呈團塊狀生長，如圖3C、3D、3E、3F所示。測量小鼠胸腔積液體積，結果顯示中藥組明顯小于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，空白組無胸腔積液生成。見圖4。

2.3各組小鼠壁層胸膜AQP1mRNA表達水平中藥組和模型組小鼠壁層胸膜AQP1 mRNA表達水平較空白組均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而中藥組相比于模型組小鼠能明顯降低AQP1 mRNA表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖5。

圖1 各組小鼠活體成像時胸腔熒光圖

圖3 各組小鼠胸腔解剖圖

圖2 各組小鼠胸腔熒光值變化折線圖

1：中藥組；2：模型組；3：空白組；與模型組比較：*P<0.01

2.4各組小鼠壁層胸膜AQP1蛋白表達水平模型組小鼠壁層胸膜AQP1蛋白表達水平顯著高于空白組小鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；中藥組與模型組相比，能顯著下調壁層胸膜AQP1蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖6。

圖5 各組小鼠壁層胸膜AQP1 mRNA表達情況

1：中藥組；2：模型組；3：空白組；與空白組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.01

3 討論

傳統(tǒng)觀點認為MPE形成的主要機制為腫瘤轉移至胸膜，刺激胸膜引起炎性反應，使臟壁層毛細血管通透性增高，大量液體滲出，或腫瘤組織阻塞淋巴管，而致淋巴液流體靜壓升高，影響淋巴液的回流[13]。但隨著現(xiàn)代分子生物學以及免疫學的迅猛發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)胸膜自身以及胸膜腔局部腫瘤細胞、免疫細胞、微血管等相互作用形成的微環(huán)境在MPE的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色，主要機制包括Ang1/2(血管生成素1/2)[14]、IL-6/Stat3通路[15]、CXCR4/CXCL12趨化軸[16]、AQPs[10]、血管內皮生長因子(VEGF)[17]、Th17/Treg[18-19]細胞平衡等。

圖6 各組小鼠壁層胸膜AQP1 蛋白表達情況

1：中藥組；2：模型組；3：空白組；與空白組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.01

其中AQPs家族中的AQP1是一類分子質量相對較低的膜內嵌蛋白，其所介導的自由水快速被動的跨生物膜轉運是水進出細胞的主要途徑。AQP1表達在壁層和臟層胸膜表面，基本功能是維持胸膜腔中的液體流入與流出平衡，腫瘤微環(huán)境可能導致AQP1表達異常，影響毛細血管和間質的液體交換，引起胸腔滲透壓改變，形成MPE，并且AQP1表達量與腫瘤惡性程度呈正相關性。因此本研究通過建立肺癌胸腔積液小鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠壁層胸膜AQP1 mRNA及蛋白表達相比于空白組小鼠均顯著升高，這與文獻[9-10]研究結果相符，證實肺癌MPE小鼠胸膜存在AQP1表達的失常。

MPE的中醫(yī)治療手段比較豐富，主要有中藥復方口服、中藥注射劑靜滴或胸腔灌注及中藥外敷等，而中藥口服最能體現(xiàn)中醫(yī)特色，具有多層次、多靶標的特點，在治療MPE中發(fā)揮著整體調節(jié)作用。如王玨 等[20]發(fā)現(xiàn)瀉肺逐飲湯可以降低MPE大鼠胸水和胸膜組織中轉化生長因子-β1(TGF-β1)、AQP1、細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)、VEGF等的含量，同時提高穿孔素(PFP)的表達，從而抑制MPE生成。吳君 等[21]發(fā)現(xiàn)解氏肺癌二號方一方面可能通過降低小鼠血清VEGF和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)含量，阻斷腫瘤血管生成，并降低血管通透性，減少積液滲出；另一方面還可上調白介素-2(IL-2)和γ干擾素(IFN-γ)表達，提高其免疫活性，增強免疫功能，達到防治MPE作用。

中藥消水方是一張臨床治療MPE的有效經(jīng)驗方，本方主要由生黃芪、白術、茯苓、葶藶子、大棗、車前子、刺五加、醋莪術、全瓜蔞、徐長卿、半枝蓮、黃芩等組成，以扶正培本為主，同時兼顧治氣、治水、治血、抗癌四個層面，具有益氣健脾、瀉肺利水、祛瘀抗癌功用，適用于正虛邪盛，水濕瘀結為患之MPE。采用該方對肺癌小鼠MPE進行干預，結果顯示消水方具有良好的抑制MPE生成的作用，相比于模型組(715±61)μl，中藥組MPE體積僅為(268±79)μl，且中藥組胸腔活體成像熒光強度明顯低于模型組熒光強度，表明消水方不僅能夠減少MPE，同時還可能對Lewis肺癌細胞本身具有一定抑制作用。

研究[22]顯示本方的主要利水組分葶藶大棗瀉肺湯可顯著降低肺癌MPE模型小鼠壁層胸膜間皮細胞AQP1及其mRNA表達水平，從而減少MPE形成。該研究在此基礎上進一步探討了消水方抑制MPE的分子機制，采用RT-PCR及Western blot檢測了各組小鼠壁層胸膜AQP1 mRNA以及蛋白表達情況，結果顯示中藥組相比于模型組小鼠能明顯降低壁層胸膜AQP1 mRNA表達，同時下調AQP1蛋白表達。表明中藥消水方可能通過下調壁層胸膜間皮細胞AQP1表達，促進胸腔MPE的轉運，抑制MPE的形成。