張 雪，劉國東，林 群，方 強(qiáng)，謝 坤，趙義軍，劉付寶

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的致命惡性腫瘤[1]。該腫瘤在美國每年的發(fā)病人數(shù)在1 300～3 000例之間[2]。慢性炎癥性病癥被認(rèn)為是肝內(nèi)膽管癌的誘因因素[3]。由于早期無明顯的癥狀、體檢尚未普及等原因致ICC明確診斷通常較晚，手術(shù)是目前最好的治療方式，術(shù)后5年生存率約20%～50%[4]。X染色體耦聯(lián)的鋅指蛋白(X-linked zinc finger protein,ZFX)位于X染色體，編碼krueppel C2H2型鋅指蛋白家族成員[5]。在胚胎細(xì)胞和成人造血干細(xì)胞具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)解作用[6]。研究[7]證明ZFX的過表達(dá)與膽囊癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展均有密不可分的關(guān)系。ZFX在肝內(nèi)膽管癌中的作用尚不明確，目前國內(nèi)外未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)運(yùn)用siRNA沉默肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的ZFX的表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株與siRNA核苷酸片段的合成 選取人膽管細(xì)胞型肝癌細(xì)胞株(cholangiocarcinoma cells,HCCC-9810)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，由上海交通大學(xué)新華醫(yī)院饋贈(zèng)；siRNA由上海漢恒生物科技公司合成；siRNA序列:5′-GTCGGAAATTGATCCTTGTAA-3′；Scr-siRNA序列: 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。使用前按說明書用DEPC水稀釋至需要濃度。

1.1.2主要試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；lipofectamine 3000試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；TRIzol裂解液購自美國Invitrogen公司；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海Promega公司；兔抗人多克隆抗體、辣根過氧化物酶人抗兔IgG二抗購自美國Genetex公司；CCK-8增殖試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HCCC-9810細(xì)胞用含15%胎牛血清、100 U/ml青霉素鏈霉素抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d調(diào)整細(xì)胞濃度至覆蓋率約60%,并用不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分組分別為Cell組(未轉(zhuǎn)染siRNA的HCCC-9810細(xì)胞組)、NC-siRNA組(轉(zhuǎn)入negative control的細(xì)胞組)、ZFX-siRNA組(轉(zhuǎn)入ZFX的細(xì)胞組)。轉(zhuǎn)染方法嚴(yán)格按照lipofectamine 3000的操作說明進(jìn)行，5 h后更換為RPMI-1640普通培養(yǎng)基。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染后ZFX的mRNA表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，使用TRIzol(Invitrogen公司)試劑提取RNA，嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行，檢測(cè)各組RNA總量，然后按照說明書使用反轉(zhuǎn)錄酶、Oligo dT(Promega)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，GAPDH作為內(nèi)參，GAPDH引物序列為：正義鏈：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′; 反義鏈：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；ZFX 引物序列為：正義鏈 5′-GGCAGTCCACAGCAAGAAC-3′；反義鏈：5′-TTGGTATCCGAGAAAGTCAGAAG-3′，以2-ΔΔt計(jì)算各組ZFX基因mRNA的表達(dá)量，每組各實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4Western blot檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞離心后，PBS洗滌3次，離心棄上清液，加入RIPA裂解液30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清液。SDS-PAGE凝膠電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，孵育兔抗人多克隆抗體(1 ∶1 000)搖床慢搖2 h，TBST慢搖清洗3次，每次5 min，二抗室溫孵育2 h，于暗室滴加ECL，覆蓋X線片曝光，顯影，拍照，保存。

1.2.5克隆形成實(shí)驗(yàn) 24孔板內(nèi)培養(yǎng)HCCC-9810細(xì)胞，覆蓋率達(dá)70%后siRNA轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，3 d后收集各組轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，各組對(duì)應(yīng)六孔板內(nèi)鋪約400個(gè)細(xì)胞，充分搖勻并顯微鏡下觀察至無細(xì)胞聚集，每2 d更換細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)至2周后4%多聚甲醛固定15 min，Giemsa染色20 min，顯微鏡下隨機(jī)抽取5個(gè)視野，分別統(tǒng)計(jì)每孔內(nèi)>50及<50個(gè)細(xì)胞的克隆細(xì)胞集落數(shù)并分析結(jié)果。

1.2.6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 持續(xù)增殖能力是癌細(xì)胞最基本的能力。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，分別接種于96孔板內(nèi)，每孔加入2×104/100 μl培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后每間隔24 h加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm處各孔的吸收值。

1.2.7Transwell遷徙、轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn) 24孔板transwell chamber(0.8 μm，美國Cornning公司)，收集各組siRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，上室內(nèi)加入200 μl不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，下室內(nèi)加入600 μl含15%FBS的培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中自然遷移條件下培養(yǎng)24 h后甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色10 min，棉簽拭去上室內(nèi)細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察轉(zhuǎn)移至下室內(nèi)的細(xì)胞并拍照、計(jì)數(shù)。轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)需每室內(nèi)加入37 ℃培養(yǎng)基200 μl 水化膠，培養(yǎng)48 h后固定染色，其他同遷徙實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1siRNA對(duì)HCCC-9810細(xì)胞ZFXmRNA表達(dá)水平的影響轉(zhuǎn)染48 h后，RT-PCR結(jié)果顯示：Cell組與NC-siRNA組之間mRNA表達(dá)水平未見明顯差異，ZFX-siRNA組mRNA表達(dá)水平與Cell組、siRNA-NC組相比下降明顯(P<0.01)，見圖1。

圖1 沉默ZFX基因?qū)CCC-9810細(xì)胞ZFX mRNA表達(dá)水平的影響

2.2siRNA轉(zhuǎn)染HCCC-9810細(xì)胞后ZFX蛋白的表達(dá)Western blot 檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相一致，Cell組與NC-siRNA組之間比較，ZFX基因表達(dá)水平未見明顯改變，ZFX-siRNA組蛋白表達(dá)水平與Cell組、NC-siRNA組相比下降明顯，RT-PCR和Western blot均證實(shí)ZFX-siRNA使HCCC-9810細(xì)胞的ZFX基因表達(dá)下調(diào)明顯。見圖2。

圖2 siRNA轉(zhuǎn)染HCCC-9810細(xì)胞后蛋白印跡圖

2.3沉默ZFX對(duì)膽管癌細(xì)胞克隆形成的影響結(jié)果顯示siRNA-ZFX實(shí)驗(yàn)組的小克隆(<50)細(xì)胞集落明顯多于Cell組及NC-siRNA組。顯微鏡下觀察結(jié)果：Cell組、NC-siRNA組之間形成克隆數(shù)、克隆形成率未見明顯差異(圖3B)，ZFX-siRNA組與NC-siRNA組相比每個(gè)克隆所包含的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(t=3.188，P=0.0333)，各組重復(fù)3次，有輕度差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲低ZFX對(duì)于肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的克隆形成能力具有重要的影響。見圖3。

圖3 沉默ZFX對(duì)膽管癌細(xì)胞克隆形成的影響

A：每個(gè)孔內(nèi)的克隆圖片；B：每個(gè)孔內(nèi)的克隆數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與NC-siRNA組比較：*P<0.05

2.4CCK-8檢測(cè)結(jié)果ZFX-siRNA組細(xì)胞增殖能力明顯弱于NC-siRNA組(F=150.3,P<0.01)及Cell組(F=151.5,P<0.01)，且隨著時(shí)間推移差異逐漸變大(圖4)，Cell組與siRNA-NC組之間及各組組內(nèi)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明敲低ZFX表達(dá)對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的增殖能力具有重要的影響。

圖4 沉默ZFX基因?qū)CCC-9810細(xì)胞增殖能力的影響

2.5沉默ZFX對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞遷徙、侵襲的影響通過siRNA下調(diào)HCCC-9810細(xì)胞中ZFX基因后，能夠顯著抑制細(xì)胞的遷移及侵襲能力(圖5)，siRNA-ZFX組與siRNA-NC(t=8.505P=0.001)組相比可見轉(zhuǎn)移到下室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，而Cell組與siRNA-NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖6顯示，siRNA-ZFX組與siRNA-NC(t=8.311，P=0.002)組相比可見轉(zhuǎn)移到下室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，而Cell組及siRNA-NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 沉默ZFX基因?qū)CCC-9810細(xì)胞遷移的影響 結(jié)晶紫染色×40 與NC-siRNA組比較： **P<0.01

圖6 沉默ZFX 基因?qū)CCC-9810細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響 ×40 結(jié)晶紫染色

3 討論

近年來，惡性腫瘤成為威脅人類健康的重要原因之一，ICC是當(dāng)今人類危害最大的惡性腫瘤之一，我國ICC發(fā)病率增值迅速，多數(shù)學(xué)者把研究重點(diǎn)放在該腫瘤的治療上，對(duì)于該腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制及重要影響的關(guān)注力度明顯不夠，不能從根本上解決ICC的治療問題。原發(fā)性肝癌分為肝細(xì)胞性肝癌、膽管細(xì)胞性肝癌和混合型肝癌，在原發(fā)性肝癌中，膽管細(xì)胞性肝癌的發(fā)生率僅次于肝細(xì)胞性肝癌[8]，目前有早期癥狀不明顯、早期診斷困難、惡性程度較高等特點(diǎn)，致膽管細(xì)胞癌明確診斷時(shí)常屬于晚期，且該腫瘤容易向周圍血管及組織浸潤，致外科手術(shù)切除困難，膽管細(xì)胞癌放療、化療敏感性較低[9]，因此對(duì)膽管細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究成為目前目標(biāo)之一。深入研究ICC發(fā)生的分子機(jī)制，尋求新的診斷及治療方法是提高ICC整體療效的關(guān)鍵。鋅指蛋白是指含有穩(wěn)定的短的能與Zn2+結(jié)合的自我折疊形成手指結(jié)構(gòu)的一類蛋白質(zhì)，鋅指蛋白可以特異的與靶結(jié)構(gòu)結(jié)合從而發(fā)生特定的影響。近期，國內(nèi)外相關(guān)研究[10-12]表明ZFX在鼻咽癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后具有密不可分的關(guān)系，同時(shí)，參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等多個(gè)過程[13-15]，而國內(nèi)外尚未見該蛋白在ICC中的生物學(xué)作用的報(bào)道。本文旨在探討ZFX在ICC細(xì)胞中的生物學(xué)功能。

惡性腫瘤的惡性程度與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、克隆等能力具有密不可分的關(guān)系，而ICC具有很強(qiáng)的早期轉(zhuǎn)移力、侵襲力強(qiáng)及預(yù)后差等特點(diǎn)，因此對(duì)于與肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及克隆能力等有影響的基因的研究成為早期診斷及靶向治療的研究方向。siRNA干擾技術(shù)是將與目的基因同源的雙鏈RNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，使與其對(duì)應(yīng)的mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)目的基因序列沉默[16]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)ZFX基因特異靶點(diǎn)的siRNA及一條陰性對(duì)照siRNA，通過lipofectamine 3000分別轉(zhuǎn)入相對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組HCCC-9810細(xì)胞系中，并通過RT-PCR、Western blot從mRNA、蛋白水平檢測(cè)ZFX基因的表達(dá)水平，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。本研究通過CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移、侵襲及克隆形成實(shí)驗(yàn)證明ZFX基因表達(dá)的敲低導(dǎo)致肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及克隆能力明顯下調(diào)，表明ZFX在HCCC-9810細(xì)胞系的生長、轉(zhuǎn)移等過程中扮演著促進(jìn)的角色。

盡管研究證明ZFX沉默對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的生物學(xué)功能具有重要影響，但具體機(jī)制尚不清楚，相關(guān)研究[17]表明在非小細(xì)胞肺癌中，miR-144過表達(dá)與ZFX的沉默能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖且能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步研究表明ZFX的表達(dá)水平可通過miR-144調(diào)節(jié)，同時(shí)，ZFX的異常表達(dá)顯著降低miR-144對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的抑制作用，表明干擾miR-144-ZFX通路或許對(duì)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要影響。Akt、ERK1/2作為ZFX調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的重要通路，NSCLC[18]、 LSCC[19]、 乳腺癌[20]和胃癌[13]中均會(huì)降低Akt、ERK1/2磷酸化作用。目前，國內(nèi)外尚未見關(guān)于ZFX基因在ICC患者細(xì)胞中表達(dá)水平的檢測(cè)、與腫瘤惡性程度及預(yù)后的關(guān)系及miR-144、Akt、ERK1/2在ZFX調(diào)節(jié)ICC的通路中扮演的角色的報(bào)道，為深入探索ZFX在臨床上的功能的作用及具體機(jī)制的研究進(jìn)一步證明ZFX在ICC的發(fā)生、發(fā)展中的作用提供理論方向。

綜上，降低ZFX在ICC細(xì)胞中的表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移及轉(zhuǎn)移能力，持續(xù)對(duì)于ZFX在肝內(nèi)膽管癌中的具體分子機(jī)制的研究將有助于進(jìn)一步了解ICC的發(fā)生、發(fā)展，為膽管細(xì)胞癌的早期診斷及分子靶向治療提供依據(jù)。