楊 明，宋 楊，張紅健，季加標，楊見明

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占頭頸部腫瘤的三分之一，病理類型以鱗狀細胞癌為主[1]。臨床上喉癌的治療主要以手術治療或者手術聯(lián)合放化療為主，患者的喉功能如吞咽、發(fā)音功能受到不同程度的影響，并降低患者生活質(zhì)量，研究新的治療方案如免疫治療對此類患者具有很大的前景[2]。白介素-17(interleukin-17，IL-17)是一種由CD4+ T Th17細胞、γδT 細胞、自然殺傷T細胞(NKT)、TCRβ+ Th17細胞分泌的促炎細胞因子[3]。IL-17在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用， 研究[4]表明IL-17通過促進腫瘤血管生成促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。研究[5]顯示IL-17可以抑制Lewis 肺癌荷瘤小鼠MDSCs細胞(髓系來源的抑制細胞)的凋亡。課題組前期研究[6]結果表明IL-17可以通過調(diào)控IL-6/IL-6R/JAK1/STAT3信號通路影響喉癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而IL-17對喉癌細胞凋亡的影響及其具體機制查閱國內(nèi)外相關文獻尚未見報道，該研究在前期研究基礎上，重點研究IL-17對喉癌細胞凋亡的影響及體外機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)上皮樣細胞Hep-2細胞，屬于人源性高分化喉癌細胞系，呈單層貼壁生長狀態(tài)，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。常規(guī)細胞培養(yǎng)基(RPMI 1640+10%胎牛血清+100 mg /L青霉素+100 mg/L 鏈霉素)培養(yǎng)Hep-2細胞，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱孵育，1～2 d傳代或者換液一次。

1.2試劑200-17(IL-17刺激劑，對IL-17具有生長刺激作用)購自美國PEPROTECH公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自美國HyClone公司；抗PI3K單克隆抗體、抗p-PI3K抗體購自美國Abcam公司；抗Fas抗體、抗FasL抗體、抗AKT抗體、抗p-AKT抗體購自美國CST公司；抗β-actin 抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購自美國ABclonal公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；BCA法蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、蛋白 Marker、胰酶、一抗稀釋液、二抗稀釋液、ECL熒光劑(顯影劑)均購自上海碧云天生物有限公司。

1.3儀器NAPCO-8800型恒溫細胞培養(yǎng)箱購自美國SHELLAB公司；SW-9800型超凈工作臺購自蘇州泰安空氣技術有限公司；Western blot電泳儀(Tanon)購自上海天能科技有限公司；CytoFLEX流式細胞儀購自美國BECKMAN COULTER公司。GraphPad Prism 6圖像處理軟件；Image-Pro plus 圖像處理系統(tǒng)。

圖1 流式細胞術檢測IL-17對Hep-2細胞凋亡的影響

1.4AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測將Hep-2細胞消化后以相同的量接種到6孔板中(接種6孔，每孔細胞數(shù)為1×106)，待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，對照組加入RPMI1640，實驗組加入含50 ng/ml 200-17的RPMI1640，分別處理6、12、24 h后胰酶消化細胞，收集至15 ml 離心管中，300 g 4 ℃ 離心5 min，棄去上清液， 用400 μl PBS 洗滌2次，Annexin V-FITC/PI 雙熒光(FITC 50 mg/L， PI 50 mg/L) 避光染色 10 min，CytoFLEX流式細胞儀檢測，CytExpert分析軟件分析檢測結果。

1.5Westernblot法檢測不同濃度200-17刺激Hep-2細胞后PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Fas、FasL蛋白表達的變化將對數(shù)生長期的Hep-2細胞消化后以相同的量接種6孔板中(接種四孔，每孔細胞數(shù)大約為1×106)，待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，在4個孔中分別加入含不同濃度200-17(0、1、50、100 ng/ml)的RPMI1640處理6 h，棄去培養(yǎng)液，4 ℃預冷PBS清洗細胞，培養(yǎng)板中加入蛋白裂解液(含PMSF及磷酸化酶抑制劑)充分裂解細胞，13 000 r/min 4 ℃離心20 min,吸取上清液；BCA試劑盒檢測蛋白濃度后分裝保存。根據(jù)測定的蛋白濃度加入相應體積的總蛋白樣品和5×loading buffer(比例為4 ∶1)，混勻后在干浴鍋中100 ℃煮10 min，蛋白變性后的樣本于-20 ℃冰箱中保存。每泳道加20 μg蛋白樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳；分離凝膠中的蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫搖床上封閉2 h。TBST 洗滌4次，每次5 min，分別與抗PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Fas、FasL、β-actin抗體4 ℃下孵育過夜。TBST洗滌4次，每次5 min，將膜置于相對應二抗內(nèi)室溫搖床下孵育1 h，TBST 洗滌5 min×4次后，ECL化學發(fā)光底物顯影檢測蛋白。用Image-Pro plus圖像處理系統(tǒng)分析計算Western blot灰度值。

2 結果

2.1IL-17刺激不同時間后Hep-2細胞的凋亡率通過Annexin V-FITC/PI雙染法檢測200-17作用6、12、24 h后Hep-2細胞的凋亡率。結果顯示，對照組和實驗組凋亡率逐漸增高，與對照組相比，加50 ng/ml 200-17作用6、12、24 h后，Hep-2凋亡率均降低，200-17作用6 h后與對照組比較，實驗組Hep-2細胞凋亡率降低最明顯。6 h對照組凋亡率為(12.56±2.51)%，6 h實驗組凋亡率為(2.47±0.96)%，12 h對照組凋亡率為(26.79±1.48)%，12 h實驗組凋亡率為(19.79±2.16)%，24 h對照組凋亡率為(32.35±1.3)%，24 h實驗組凋亡率為(24.10±1.17)%。采用t檢驗比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=4. 629，P<0. 01)。見圖1。

2.2不同濃度200-17刺激Hep-2細胞時PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Fas、FasL蛋白的表達用不同濃度(0、1、50、100 ng/ml)的200-17刺激Hep-2細胞，隨著200-17濃度的升高，Hep-2細胞中p-PI3K、p-AKT蛋白的表達逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；PI3K、AKT蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。與0 ng/ml組相比，1、50、100 ng/ml組200-17刺激后Hep-2細胞內(nèi)Fas、FasL蛋白表達降低(t=-3.258、-2.738，P<0.01) 。隨著200-17濃度升高，F(xiàn)asL表達逐漸降低；與對照組、1 ng/ml組相比，100 ng/ml組Fas蛋白表達降低，然而與50 ng/ml組相比，F(xiàn)as表達增高(t=-4.247，P<0.01)。見圖2。

圖2 不同濃度IL-17刺激下Hep-2細胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、FAS、FASL分子表達的變化

1：0 ng/ml 200-17組；2：1 ng/ml 200-17組；3：50 ng/ml 200-17組；4：100 ng/ml 200-17組；與0 ng/ml 200-17組比較：**P<0.01

3 討論

喉鱗狀細胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，占全身惡性腫瘤的1%～2.5%[7]。目前喉癌的主要治療方法包括手術、放療、手術聯(lián)合放療/化療的綜合治療[2]。手術治療后患者發(fā)音功能重建效果不佳，部分患者喉功能完全損失，對患者生存質(zhì)量造成較大影響，開發(fā)新的治療方案如免疫治療非常有必要[8]。

IL-17是一種由多種細胞分泌的促炎細胞因子， IL-17與其受體結合后，可以作用于巨噬細胞、T細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞等多種細胞，誘導IL-6、IL-1β、TNF-α等多種促炎因子和CXCL-1、 CXCL-8、 CXCL-10、MCP-1等趨化因子從而發(fā)揮促炎作用，同時IL-17與自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[9-10]。研究[9]表明IL-17通過激活Src/PI3K/Akt/nuclear factor-κB (NF-κB)、MAPK、 Stat3、COX-2信號通路在調(diào)控腫瘤生長、參與腫瘤血管生成及侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-絲氨酸蘇氨酸激酶(AKT)信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，是與細胞增殖和細胞凋亡關系最密切的信號通路之一，并有望成為惡性腫瘤治療的新靶點[11]。頭頸部腫瘤中PI3K信號通路的異常激活能促進腫瘤的異常增殖及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11-12]。研究[13]顯示在星形膠質(zhì)瘤細胞中IL-17能夠激活PI3K/AKT信號通路。本研究用不同濃度IL-17刺激Hep-2細胞后，采用Western blot分析PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達，結果顯示，采用不同濃度(0、1、50、100 ng/ml)IL-17處理Hep-2細胞6 h后，隨著濃度增加，p-PI3K、p-AKT表達逐漸增加，呈濃度依賴性。提示IL-17能夠激活Hep-2細胞中PI3K/AKT信號通路。

Fas和FasL(Fas配體)分別是腫瘤壞死因子(TNF)受體和TNF家族成員，F(xiàn)as介導的凋亡途徑是腫瘤細胞凋亡的主要途徑之一，F(xiàn)as與FasL的結合導致caspase級聯(lián)反應進而導致細胞凋亡[14]。Fas介導的凋亡途徑在免疫監(jiān)視和維持體內(nèi)平衡中起關鍵作用，并且是藥物誘導的凋亡的介質(zhì)[14]。研究[15]顯示磷酸化AKT能夠活化Forkhead家族成員FOXO轉(zhuǎn)錄因子，下調(diào)FasL誘導的凋亡過程。Western blot結果顯示，與對照組相比，實驗組p-AKT表達逐漸增加，F(xiàn)as、FasL表達降低，此結果支持磷酸化AKT下調(diào)FasL的表達從而下調(diào)Fas介導的凋亡途徑的觀點。與對照組、1 ng/ml組比較，100 ng/ml組Fas蛋白表達降低，然而與50 ng/ml組相比，F(xiàn)as表達增高，考慮可能與Fas的表達在200-17濃度為50、100 ng/ml時進入平臺期有關[16]。采用流式細胞術檢測細胞凋亡，結果顯示，與對照組相比，采用50 ng/ml 200-17處理Hep-2細胞6、12、24 h后，Hep-2細胞凋亡率減少。結合以上，本研究的結果提示，IL-17可以抑制Hep-2細胞凋亡。