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Ov-ASP-1是盤尾絲蟲L3時(shí)期分泌的一種重要蛋白，研究發(fā)現(xiàn)Ov-ASP-1不僅自身能有效誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，還能增強(qiáng)多種抗原或疫苗的免疫原性[1-4]。但至今Ov-ASP-1的佐劑活性功能區(qū)仍然未知。因此前期我們對Ov-ASP-1全長序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)并合成了9個(gè)肽用于佐劑活性功能區(qū)的探索。根據(jù)前期制備的Ov-ASP-1單克隆抗體和9個(gè)肽的結(jié)合情況，我們發(fā)現(xiàn)了Ov-ASP-1上的B細(xì)胞優(yōu)勢表位及Th表位所在的氨基酸序列。并以晶體空間結(jié)構(gòu)相似的同家族蛋白Na-ASP-2為模型[5]，設(shè)計(jì)了Ov- ASP-1佐劑活性功能片段ASPPRM，它包含完整 PR-1核心結(jié)構(gòu)域[6-7]和優(yōu)勢Th表位，同時(shí)去除B細(xì)胞優(yōu)勢表位。

本研究根據(jù)前期Ov-ASP-1單克隆抗體的研究結(jié)果[8]，設(shè)計(jì)并優(yōu)化表達(dá)了Ov- ASP-1的功能區(qū) ASPPRM重組蛋白，并通過免疫小鼠進(jìn)行生物學(xué)特性分析。因此本研究為進(jìn)一步研究ASPPRM在體內(nèi)的免疫增效作用及Ov-ASP-1佐劑活性功能區(qū)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 克隆載體PMD18T為TaKaRa公司產(chǎn)品；表達(dá)載體 pQE30為QIAGEN公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶購自 NEB公司，質(zhì)粒提取試劑盒及感受態(tài) DH5α為北京全式金生物科技公司產(chǎn)品?？敲顾亍Ⅳ绕S青霉素為中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品， IPTG購自金科宏達(dá)公司， Ni-charged resin及內(nèi)毒素鱟試劑檢測試劑盒購自金斯瑞公司，去內(nèi)毒素凝膠(Detoxi-Gel Endotoxin Removing Gel)購自 Thermo公司， PEG-6000購自 Roche公司，蛋白 Marker、蛋白定量試劑盒購自天根公司，鼠抗 His抗體、 HRP-山羊抗小鼠 IgG抗體購自北京中杉金橋公司， ELISA顯色液 A、 B及終止液購自北京萬泰生物制藥公司，超敏發(fā)光液購自北京 MILLIPORE公司， PVDF膜購自 MILLIPORE公司，透析袋 MD34為北京瑞達(dá)恒輝公司產(chǎn)品，酶聯(lián)免疫檢測儀(ELx808)購自 BioTek公司。感受態(tài)細(xì)胞 M15為本室保存。

1.2 方法

1.2.1Ov-ASP-1功能區(qū)ASPPRM的設(shè)計(jì) 根據(jù)前期Ov-ASP-1單克隆抗體的研究結(jié)果[8]，在保留Ov- ASP-1佐劑活性功能區(qū)的前提下，盡量去除 B細(xì)胞優(yōu)勢表位，使自身抗體反應(yīng)減弱，因此從全長Ov-ASP-1氨基酸序列上去掉前端 P2(21-35 aa)所在氨基酸序列。又保留了能引起較強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)的P14(175-190 aa)所在氨基酸序列，設(shè)計(jì)了包含155個(gè)氨基酸殘基的Ov-ASP-1的功能域，命名為ASPPRM。根據(jù)原核表達(dá)的密碼子偏性特征，對APPRM進(jìn)行密碼子優(yōu)化處理并在其基因兩端插入BamH I和HindIII兩個(gè)酶切位點(diǎn)，送南京金斯瑞公司全基因合成。

1.2.2重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30/ASPPRM的構(gòu)建 將全基因合成的 ASPPRM連接至 PMD18 T，用BamHⅠ、HindⅢ雙酶切并回收 ASPPRM基因，連接至 pQE30上構(gòu)建重組質(zhì)粒 pQE30/ ASPPR，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞 M15，培養(yǎng)得到 pQE30/ M15/ ASPPRM。

1.2.3重組蛋白ASPPRM的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)特性分析 將復(fù)蘇鑒定正確的pQE30/ASPPRM甘油菌以1∶100的比例接種于含Amp 、Kan 的雙抗LB培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩、 200 r/min培養(yǎng)2.5 h。然后在誘導(dǎo)的菌液中加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)4 h，取菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析，同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)(即不加 IPTG)為對照組。同時(shí)將收集的菌液進(jìn)行Western Blot檢測確定pQE30/ASPPRM是否正確表達(dá)目的蛋白。

1.2.4重組蛋白ASPPRM的大量表達(dá)及純化 ASPPRM重組蛋白表達(dá)純化的步驟參照文獻(xiàn)[2]并結(jié)合Ov-ASP-1的純化復(fù)性方法進(jìn)行。即大量誘導(dǎo)表達(dá)后，將收集的新鮮菌液用超聲裂解(條件為冰浴條件下功率200 W，超聲2 s，間歇2 s，共裂解30 min)。12 000 r/min離心10 min后得到粗制包涵體，再用包涵體洗液Ⅰ(0.5 TritonX-100，10 mmol/ L EDTA)、Ⅱ(10 TritonX-100，10 mmol/ L EDTA)、Ⅲ(10 mmol/ LEDTA，2 mol/ L尿素)依次重懸洗滌，最后將包涵體沉淀用8 mol/ L尿素重懸處理達(dá)到包涵體變性的目的，4 ℃過夜。次日4 ℃ 12 000 r/min，離心40 min。后用0.45 μm濾器過濾后上柱。依據(jù)Ni柱說明書，分別用從濃度到低濃度的咪唑進(jìn)行洗脫，收集各梯度洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5重組蛋白ASPPRM的復(fù)性及內(nèi)毒素檢測 根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果將純度較高的洗脫液置于透析袋中，利用梯度復(fù)性法，即從6 mol/L—4 mol/L—laemmili(25 mmol/ L Tris，192 mmol/ L 甘氨酸，0.1% SDS，pH=8.3)—PBS在4 ℃進(jìn)行透析復(fù)性。復(fù)性結(jié)束收集蛋白用Balford法測定蛋白濃度，參照天根公司考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒說明書。最后根據(jù)鱟試劑說明書對ASPPRM蛋白進(jìn)行內(nèi)毒素檢測，去內(nèi)毒素后分裝保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6重組蛋白ASPPRM的生物活性分析 將BALB/c 雌性小鼠隨機(jī)分組，每組6只，共4組，分組依次為ASPPRM+OVA、Ov-ASP-1+OVA組、OVA及PBS對照。蛋白抗原OVA: 10 μg/只，ASPPRM蛋白及Ov-ASP-1蛋白(均25 μg/只/次)溶于PBS中使用。每只小鼠免疫200 μL。免疫途徑采用肌肉注射免疫。間隔3周免疫1次，共免疫2次。免疫后2周小鼠尾靜脈采血并分離血清用于ASPPRM特異性IgG抗體效價(jià)的ELISA檢測。以O(shè)VA為抗原進(jìn)行包被4 ℃過夜，包被濃度為1 μg/mL，以待檢小鼠血清為一抗37 ℃孵育 1 h，以羊抗鼠的IgG-HRP按1∶5000稀釋作為二抗37 ℃孵育 1 h，酶標(biāo)儀檢測D450值>2倍對照組D450平均值即判斷為陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS17.0版本進(jìn)方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作圖用GraphPad軟件5.01版本。

2 結(jié) 果

2.1重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30 /ASPPRM的構(gòu)建及酶切鑒定 根據(jù)前期Ov-ASP-1單克隆抗體的研究結(jié)果[8]，去掉B細(xì)胞優(yōu)勢表位所在的氨基酸序列P2(21-35 aa)，并保留了能引起較強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)的P14(175-190 aa)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行密碼子優(yōu)化，設(shè)計(jì)了包含155個(gè)氨基酸殘基的Ov-ASP-1功能片段ASPPRM。全基因合成后連接至原核表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30 /ASPPRM。如圖1所示，用BamH I單酶切重組質(zhì)粒后，得到大于3.4 kb的單一條帶(圖1，第4條泳道)。經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切后，得到與載體pQE30(3.4 kb)和ASPPRM基因(465 bp)大小相符的兩條帶(圖1，第3條泳道)。為進(jìn)一步驗(yàn)證送公司測序，序列完全正確。以上結(jié)果證實(shí)重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30/M15/ASPPR構(gòu)建成功。

注：M：Trans2K Plus DNA Marker；1: BamH I和Hind III雙酶切空載體pQE30；2：ASPPRM經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3：BamH I和Hind III雙酶切重組質(zhì)粒pQE30 /ASPPRM；4：BamH I酶切pQE30 /ASPPRM；5：重組質(zhì)粒pQE30 /ASPPRM圖1 重組質(zhì)粒pQE30/ASPPRM 酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pQE30/ASPPRM enzyme digestion

2.2ASPPRM的誘導(dǎo)表達(dá)及Western Blot鑒定 經(jīng)SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示(圖2A)，ASPPRM連接于pQE30載體后，經(jīng)IPTG 1 mmol/L，220 r/min，37 ℃誘導(dǎo)4 h能在M15大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)，在原核表達(dá)系統(tǒng)中ASPPR蛋白大小約為17 kD，而未加誘導(dǎo)劑的菌液則無法產(chǎn)生目的蛋白。為檢測是否正確表達(dá)目的蛋白，進(jìn)一步應(yīng)用山羊抗小鼠His抗體作為一抗對 ASPPRM進(jìn)行Western Blot鑒定，結(jié)果表明我們成功獲得了Ov-ASP-1的功能片段的重組蛋白ASPPRM(圖2B)。

注：M：protein ruler I (14-100 kD)；1：未誘導(dǎo)；2：誘導(dǎo)圖2 ASPPRM重組蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)后的SDS-PAGE(A)及Western Blot鑒定(B)Fig.2 Identification of expression of the recombinant protein ASPPRM by SDS-PAGE and Western blot

2.3ASPPRM蛋白的純化及復(fù)性 由于前期設(shè)計(jì)的功能片段ASPPRM上帶有His標(biāo)簽，因此利用鎳離子柱親和層析的方法進(jìn)行純化。如圖3所示，超聲上清中幾乎沒有目的蛋白，而8 mol/L脲溶解液中有大量目的蛋白，因此ASPPRM蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。從低濃度的咪唑(20 mmol/L，50 mmol/L)洗滌緩沖液洗滌開始，即可洗脫下來較高純度的ASPPRM蛋白及少量雜蛋白，而高濃度的咪唑(100 mmol/L、200 mmol/L)洗脫液中同樣有目的蛋白，且純度達(dá)到90%以上。在30 kD左右位置也可見微量的二聚體形式的目的蛋白。因此收集50 mmol/L、100 mmol/L及200 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫下來的蛋白均可用于進(jìn)一步復(fù)性。

注：M：protein ruler I (14-100 kd)；1：未誘導(dǎo);2：誘導(dǎo); 3：超聲上清；4：8 mol/L脲溶解液; 5：包涵體沉淀; 6：蛋白穿柱液; 7：20 mmol/L咪唑洗滌緩沖液; 8：50 mmol/L咪唑洗滌緩沖液; 9：100 mmol/L咪唑洗脫緩沖液; 10：200 mmol/L咪唑洗脫緩沖液圖3 ASPPRM在大腸桿菌中表達(dá)及純化Fig.3 Expression and purification of the recombinant protein ASPPRM

2.4ASPPRM蛋白的Western Blot鑒定 為了驗(yàn)證本研究中表達(dá)純化的ASPPRM就是本研究期望得到的蛋白，我們以山羊抗小鼠His抗體作為一抗，對ASPPRM和Ov-ASP-1進(jìn)行Western Blot鑒定。結(jié)果如圖4B所示，山羊抗小鼠His抗體能與ASPPRM、Ov-ASP-1產(chǎn)生特異性的結(jié)合，且條帶位置和SDS-PAGE(圖4A)上一致。因此以上結(jié)果充分說明了ASPPRM就是我們需要的Ov-ASP-1的功能片段蛋白。

2.5ASPPRM的生物學(xué)活性分析 經(jīng)鱟試劑檢測，樣品內(nèi)毒素含量小于 0.025 EU/mL，符合免疫小鼠的安全使用標(biāo)準(zhǔn)。OVA由于在無佐劑情況下無法誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，常作為模式抗原應(yīng)用于佐劑活

性的研究。因此我們以O(shè)VA作為模式抗原來初步評價(jià)ASPPRM是否具有佐劑活性。由圖5可知，二免后2周間接ELISA檢測結(jié)果顯示，ASP-PRM+OVA組產(chǎn)生的IgG抗體高于OVA不加佐劑組的IgG抗體(圖5B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與Ov-ASP-1組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，而免疫前四組小鼠血清中均無抗體(圖5A)。這說明ASPPRM具有增強(qiáng)OVA免疫原性的作用，顯示其可能具有佐劑活性。

注：M：protein ruler I (14-100 kD)圖4 重組蛋白Ov-ASP-1和ASPPRM復(fù)性后的SDS-PAGE(A)及Western Blot鑒定(B)Fig.4 Identification of the recombinant protein ASP-1 and ASPPRM after renaturing by SDS-PAGE and Western blot

圖5 免疫前(A)及二免后2周(B)小鼠血清中抗OVA抗體IgG檢測Fig.5 Anti-OVA IgG antibody titer in BALB/c immunized with ASPPRM and OVA

接著，我們進(jìn)一步分析ASPPRM誘導(dǎo)的IgG抗體亞類的產(chǎn)生情況。間接ELISA檢測IgG1抗體發(fā)現(xiàn)，ASPPRM組產(chǎn)生的IgG1抗體高于不加佐劑組及PBS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與Ov-ASP-1組比較，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖6B)。檢測IgG2a的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASPPRM組產(chǎn)生的IgG2a與Ov-ASP-1相當(dāng)，但高于不加佐劑組及PBS組(圖6C)。

綜上所述，ASPPRM不但具有免疫增效作用，而且其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有Th1型偏倚的特點(diǎn)。因此我們設(shè)計(jì)并表達(dá)的重組蛋白ASPPRM保留了Ov-ASP-1的佐劑活性，可進(jìn)一步以多種模式抗原系統(tǒng)性分析ASPPRM的佐劑活性。

A：抗OVA特異性IgG；B：抗OVA亞類IgG1；C：抗OVA亞類IgG2a圖6 二免后2周小鼠血清中抗OVA抗體IgG及亞類檢測Fig.6 Anti-OVA antibody in BALB/c immunized with ASPPRM and OVA

3 討 論

目前國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)蠕蟲來源的免疫調(diào)節(jié)劑在疾病的新型療法上有不可估量的應(yīng)用價(jià)值，例如一種源于絳蟲囊尾蚴設(shè)計(jì)合成，分子量為19個(gè)氨基酸的肽(GK-1)，研究發(fā)現(xiàn)其具有佐劑活性。研究人員將其和滅活的流感疫苗共同免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)針對抗流感病毒的抗體增加，且具有減少局部炎癥反應(yīng)并提高機(jī)體清除病毒的能力[9]。再如，有研究者發(fā)現(xiàn)在炎癥中常見的熱休克蛋白(HSP)，在機(jī)體中可參與抗原提呈、T細(xì)胞活化等免疫應(yīng)答的一系列過程，也具有獨(dú)特的佐劑活性[10]。然而這兩種蠕蟲來源的新型免疫調(diào)節(jié)劑的特點(diǎn)是優(yōu)先誘導(dǎo)Th2型體液免疫應(yīng)答，但幾乎無法誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)。眾所周知，細(xì)胞免疫是針對細(xì)胞內(nèi)的病原體，尤其是機(jī)體對抗病毒所不可或缺的免疫應(yīng)答方式。因此如今迫切需要一種安全無毒又能有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的新型佐劑來應(yīng)對各種傳染病，尤其是以病毒為病原體的傳染病。

許多寄生蟲體內(nèi)都存在ASP蛋白，例如犬鉤蟲，十二指腸鉤蟲，美洲鉤蟲，盤尾絲蟲，馬來絲蟲，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲等[11]。而Ov-ASP-1是盤尾絲蟲L3時(shí)期分泌的一種重要蛋白[12]，研究人員發(fā)現(xiàn)Ov-ASP-1單獨(dú)免疫小鼠時(shí)，就可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的IgG1、IgG2a。因此推測其在宿主體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)功能，具有佐劑的潛在價(jià)值。于是進(jìn)一步將Ov-ASP-1以佐劑的形式和多種形式抗原如蛋白抗原、多肽抗原或滅活疫苗分別免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其均能增強(qiáng)這些抗原的免疫原性，而且從產(chǎn)生的抗體類型看能同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th1/Th2型體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，甚至具有Th1型優(yōu)勢[13-15]。但至今Ov-ASP-1的佐劑活性功能區(qū)仍然未知。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ASPPRM有可能是Ov-ASP-1的功能區(qū)，因?yàn)樗哂袧撛诘淖魟┗钚?，而且在PBS中比Ov-ASP-1穩(wěn)定性更好，易于保存。

Ov-ASP-1與Na-ASP-2同屬CAP(cysteine-rich secretory proteins (CRISPS), antigen 5 (Ag5), and pathogenesis-related 1 (Pr-1))蛋白超家族[6]，采用在線SWISS-MODEL軟件對Ov-ASP-1 和Na-ASP-2蛋白(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫：1U53)作同源性分析，盡管同源性為35%，但二者空間結(jié)構(gòu)十分相似[5]。由于Na-ASP-2的晶體結(jié)構(gòu)已成功解析，分析發(fā)現(xiàn)其具有CAP超蛋白家族中特征性的PR-1核心結(jié)構(gòu)域。因此我們試圖對照Na-ASP-2的結(jié)構(gòu)特征來預(yù)測分析Ov-ASP-1的空間結(jié)構(gòu)，并尋找ASP-1可能的佐劑活性功能區(qū)。

前期我們對Ov-ASP-1全長序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)并合成了9個(gè)肽用于佐劑活性功能區(qū)的探索。根據(jù)ASP-1單克隆抗體的研究結(jié)果[8]，我們發(fā)現(xiàn)9個(gè)肽中P2(21-35 aa)和P7(96-111 aa) 能與Ov-ASP-1的單克隆抗體血清發(fā)生特異性結(jié)合。因此，我們推測P2和P7是B細(xì)胞優(yōu)勢表位，所誘導(dǎo)的自身免疫原性較強(qiáng)。為了保持中間結(jié)構(gòu)的完整性，我們保留了P7但去除了P2所在的氨基酸序列。同時(shí)通過ELISPOT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有P14(175-190 aa)能刺激T細(xì)胞分泌IFN-γ。由于在介導(dǎo)胞內(nèi)病毒殺傷作用中，Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答起到非常重要的作用。因此，我們推測保留了P14這個(gè)Th表位的ASPPRM具有引起較強(qiáng)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)的優(yōu)勢，有利于病毒的清除。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一推測，ASPPRM組小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的IgG2a抗體高于不加佐劑組，具有Th1型偏倚的特點(diǎn)。綜合以上結(jié)果，我們設(shè)計(jì)了一個(gè)Ov-ASP-1的功能片段，命名為ASPPRM(35-189 aa)，它既保留了完整的PR-1保守區(qū)域和末端Th1型表位所在氨基酸序列，又去掉了前端B細(xì)胞優(yōu)勢表位所在氨基酸序列。研究結(jié)果顯示，我們設(shè)計(jì)的ASPPRM在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)，重組蛋白大小在17kd左右，而且在PBS中它比Ov-ASP-1穩(wěn)定性更好，易于保存。通過WB鑒定發(fā)現(xiàn)，重組蛋白ASPPRM就是我們想要獲得的蛋白。

綜上所述，我們成功制備了具有生物活性的ASPPRM蛋白，為系統(tǒng)研究Ov-ASP-1佐劑活性結(jié)構(gòu)域的功能奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為系統(tǒng)研究 ASPPRM 的免疫增效作用和對不同抗原(蛋白、多肽等)的免疫增強(qiáng)作用奠定了基礎(chǔ)。