王文婷 劉濤 宋海峰

[摘要]目的：探討瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（Keloid Fibroblast， KFs）對不同劑量淺層電子線照射的生物學(xué)反應(yīng)及術(shù)后即時淺層電子線放射治療瘢痕疙瘩的最佳劑量。方法：以人KFs為研究對象，MTT法觀察不同劑量淺層電子線照射對KFs增殖的影響，顯微鏡觀察其形態(tài)變化。將120例瘢痕疙瘩患者隨機分為四組，術(shù)后24h內(nèi)淺層電子線照射劑量分別為2Gy、2.5Gy、3Gy、4Gy，每日照射1次，共照射6次，總劑量為12～24Gy，隨訪觀察其療效及不良反應(yīng)。結(jié)果：KFs增殖與淺層電子線照射劑量有關(guān)，且照射劑量越大，成纖維細(xì)胞活力越低；3Gy連續(xù)照射6d（總劑量18Gy）對臨床瘢痕疙瘩術(shù)后療效最好。結(jié)論：術(shù)后聯(lián)合合適劑量的淺層電子線照射治療是防治瘢痕疙瘩的可靠方法。

[關(guān)鍵詞]瘢痕疙瘩；成纖維細(xì)胞；淺層電子線照射治療；劑量

[中圖分類號]R619+.6 [文獻標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）07-0087-03

Abstract： Objective Exploration the biology reaction of Fibroblast in prothorax keloid with different doses of shallow electron irradiation and the optimum dose for clinical postoperative instant shallow electron radiotherapy dose for KD. Methods Human keloid fibroblasts are selected as the research object and the effect of different doses on the effect of KFs proliferationwas determined by MTT method， and themorphological changes was observed by microscope； 120 KD patients were divided into four groups and the dose of postoperative shallow electron irradiation within 24 h were 2 Gy，2.5 Gy，3 Gy，4 Gy， respectively. One irradiation a day and the total radiation times is 6， the total dose of 12-24 Gy， and the curative effect and adverse reaction is follow-up observed. Results The proliferation inhibition rate of keloid fibroblasts is associated with shallow electron irradiation dose and the fibroblast proliferation inhibition rate is in proportion to irradiation dose； 3 Gy lasting for six days， namely， the 18 Gy total dose has best curative effect for clinical keloids of postoperative shallow electron radiotherapy. Conclusion Postoperative treatment in combination with appropriate dose of shallow electron irradiation is a reliable method in prevention and therapy of keloid.

Key words： keloid； fibroblasts； shallow electron beam radiotherapy； dose

瘢痕疙瘩（keloid）是臨床常見的纖維結(jié)締組織增生性疾病，主要表現(xiàn)為皮膚損傷（如創(chuàng)傷、燒傷或手術(shù)）愈合過程中成纖維細(xì)胞的異常增殖及膠原過度沉積，呈蟹足狀并超出原有傷口范圍浸潤性生長，且常伴有痛癢感和質(zhì)地的變性[1]，給患者帶來美容和心理問題，嚴(yán)重影響其美觀和生活質(zhì)量，患者求治心切，對治療效果的期望值高。單純手術(shù)切除后，瘢痕疙瘩的復(fù)發(fā)率高達45%～100%[2]。手術(shù)切除后早期聯(lián)合淺層電子線治療是最常用的方法，然而關(guān)于瘢痕疙瘩術(shù)后照射使用的射線，劑量分次及總劑量等有較多研究，但意見并不一致，因此建立統(tǒng)一的術(shù)后淺層電子線照射標(biāo)準(zhǔn)很有必要[3]。本研究首先觀察不同劑量淺層電子線對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，繼而將臨床患者分為四組，觀察術(shù)后不同淺層電子線照射劑量對防治后背部瘢痕疙瘩的療效。

1 資料和方法

1.1 臨床資料：120例標(biāo)本取自2009年6月-2014年6月就診于筆者科室的瘢痕疙瘩住院患者，均為初次就診，此前未接受過任何治療，無全身其它器質(zhì)性疾病，同時經(jīng)病理診斷確診為瘢痕疙瘩。其中男32例，女88例，年齡20～40歲（平均年齡23.7歲），大小為1.0cm×0.2cm×1.0cm～6cm×5cm×3cm，病史2～10年，病變均分布在后背部。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 治療方法

1.2.1 儀器及試劑：成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基（Cell Therapy Systems，美國Gibco公司）；2.5g/l胰蛋白酶（美國HyClon公司）；胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）；MTT和二甲基亞砜（DMSO）（上海生物工程公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國thermo公司），F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）；Varian clinic 21EX醫(yī)用直線電子照射儀 （美國Varian公司）。

1.2.2 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：標(biāo)本取自筆者科室住院患者，女1例，年齡25.8歲，位于后背部，經(jīng)病理診斷確診為瘢痕疙瘩，簽署知情同意書。手術(shù)獲得瘢痕疙瘩標(biāo)本，組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液（含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清和雙抗溶液）中。0.25%胰蛋白酶消化傳代，選取培養(yǎng)的第3代KFs用于實驗。

1.2.3 MTT檢測電子線照射后KFs增殖：用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔1 000～10 000個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul。按照單次照射劑量將KFs分為7組，每組設(shè)3個復(fù)孔，每組均設(shè)空白對照（不進行電子束照射）。分別用Varian clinic 21EX醫(yī)用直線電子照射儀產(chǎn)生的6MeV電子線進行照射，照射深度為1cm（使6MeV電子線的最高照射劑量點落于細(xì)胞上）。單次照射劑量分別為1Gy、1.5Gy、2Gy、2.5Gy、3Gy、3.5Gy、4Gy，隔日照射，共照射6次，總劑量控制在6～24Gy。培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)淺層電子束照射后，繼續(xù)培養(yǎng)8h，MTT法檢測細(xì)胞增殖，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.2.4 治療過程：將120例患者按照單次照射劑量分為四組，每組30例，所有患者先行手術(shù)切除瘢痕疙瘩，手術(shù)切除后24h內(nèi)開始接受放射治療。照射野包括手術(shù)切口縫線外擴5mm范圍。所有患者均采用6MeV電子束照射，為提高皮膚表面劑量，表面加5mm厚填充物。四組照射單次劑量分別為2Gy、2.5Gy、3Gy、4Gy，每日照射1次，共照射6次，總劑量控制在6～24Gy。每次放療后重新消毒照射區(qū)，用無菌敷料覆蓋手術(shù)切口以防止感染。

1.3 隨訪及療效判定標(biāo)準(zhǔn)：120例患者均完成治療和2年隨訪，術(shù)后半年內(nèi)，1個月隨訪1次，半年后，每3個月隨訪1次，通過電話及復(fù)診觀察的方式進行隨訪。臨床療效標(biāo)準(zhǔn)參考Darzi的瘢痕疙瘩療效原則[4]，根據(jù)瘢痕厚度、自覺癥狀改善程度評價。治愈：隨訪1年以上未出現(xiàn)新病灶及舊病灶的復(fù)發(fā)，且瘢痕疙瘩癢痛癥狀消失，皮損全部變平變軟；顯效：隨訪1年未增大，瘙癢癥狀消失或基本消失，皮損局部變平；無效：癢痛癥狀有所減輕或無變化，或已達到有效標(biāo)準(zhǔn)但1年內(nèi)局部復(fù)發(fā)。其中無效計為復(fù)發(fā)，治愈與顯效計為有效。放療相關(guān)急性反應(yīng)采用美國腫瘤放射治療組（RTOG）急性放射損傷分級標(biāo)準(zhǔn)，晚期放射反應(yīng)采用IENT-SOMA分級標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，各組間計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量淺層電子線照射對人KFs增殖的影響：傳3代瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞進行淺層電子線照射，修復(fù)8h后，MTT法檢測人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖，結(jié)果如圖1所示。1Gy、1.5Gy時細(xì)胞增殖抑制率分別為（10.87±2.61）%和（20.25±3.25）%，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；2Gy、2.5Gy時細(xì)胞增殖抑制率分別為（55.21±0.97）%和（87.22±3.15）%；3Gy時細(xì)胞增殖抑制率為（90.10±3.44）%，3.5Gy和4Gy時細(xì)胞增殖抑制率分別為（98.65±2.98）%和（99.88±3.15）%，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異。表明瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞活力與淺層電子線照射劑量有關(guān)，且照射劑量越大，成纖維細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)目越少。

2.2 不同劑量淺層電子線照射后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞形態(tài)變化：成熟的成纖維細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞呈長梭形或不規(guī)則形，漩渦狀或放射狀排列，細(xì)胞核清晰，可見雙核及多核細(xì)胞，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，細(xì)胞間以細(xì)長突起相互交連。不同劑量淺層電子線照射后，部分細(xì)胞脫壁，各結(jié)構(gòu)模糊，見圖2。

2.3 不同劑量淺層電子線照射對瘢痕疙瘩術(shù)后預(yù)防復(fù)發(fā)的臨床療效評估：120例患者隨訪2年，臨床治療結(jié)果及不良反應(yīng)比較，見表1。

經(jīng)過6次照射后，有效共97例，總有效率為80.83%，無效23例，占19.17%，其中2Gy組、2.5Gy組患者治療效果不佳，復(fù)發(fā)率較高。3Gy組有效率高，復(fù)發(fā)率低。4Gy組患者不良反應(yīng)率較高。未發(fā)現(xiàn)急慢性放射性皮膚損傷及與放射線損害相關(guān)的全身不良反應(yīng)及傷口感染等并發(fā)癥，見圖3。

3 討論

瘢痕疙瘩由于真皮損傷后成纖維細(xì)胞過度增殖，組織膠原大量沉積而造成，呈侵襲性生長，破壞人體表面的完整性和連續(xù)性，發(fā)生在關(guān)節(jié)處可引起功能障礙，局部有刺癢、破潰，給患者身心帶來很大痛苦[5]。纖維化是瘢痕組織形成的主要病理過程，適度纖維化有利于皮膚愈合，一旦纖維化過度則容易引起瘢痕疙瘩，因此對纖維化的適度調(diào)控是抑制瘢痕疙瘩形成的關(guān)鍵因素[6]。術(shù)后24～48h，在炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)上，由病變部分的成纖維細(xì)胞源性細(xì)胞分化成為幼稚成纖維細(xì)胞。在此期間，成纖維細(xì)胞源性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的分裂、增殖進入最活躍狀態(tài)且對放射線較敏感，電子線可抑制術(shù)后炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞反應(yīng)及其所誘發(fā)的成纖維源性細(xì)胞增生[7]。本研究對傳3代的KFs進行淺層電子線照射，修復(fù)8h后，通過MTT法檢測淺層電子線抑制KFs增殖，表明瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞活力與淺層電子線照射劑量有關(guān)，且照射劑量越大，成纖維細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)目越少，提示淺層電子線放射治療使成纖維細(xì)胞來源和數(shù)量明顯減少，從而減少膠原產(chǎn)生，瘢痕形成受到抑制。Ji等[8]發(fā)現(xiàn)，X射線能夠有效抑制Fb增殖，擾亂細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞過早衰老，抑制切口處毛細(xì)血管增生，防止瘢痕疙瘩的復(fù)發(fā)。與光子和傳統(tǒng)的深部X線相比，電子線能提供較好的劑量分布，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的同時，能夠更好地保護深部正常組織，具有劑量學(xué)優(yōu)勢[9]。

瘢痕疙瘩好發(fā)于前胸、后背、頸項、背部、耳垂、上臂和面頰等部位，其發(fā)病與牽張力有密切的關(guān)系[10]。同時，張力大的部位，復(fù)發(fā)率高，復(fù)發(fā)率最高的部位是胸背部，其次是頭頸部。瘢痕疙瘩術(shù)后放射線治療時，治療部位、單次劑量、治療時間長短、總劑量均對放射治療效果有重要影響[11]。Ogawa等[12]認(rèn)為放射劑量與治療部位有關(guān)，初次治療張力大、復(fù)發(fā)率高的部位用15Gy，逐步增加放射劑量，張力小的部位用15Gy或小于15Gy即可；王慶國等[13]研究提示大分割（5Gy）、短療程（連續(xù)4d）的放療效果較好。本研究臨床觀察表明，術(shù)后淺層電子線照射3Gy組有效率為93.3%，復(fù)發(fā)率為6.67%，取得了較好的局部控制效果，提示術(shù)后24h，3Gy連照6d為最優(yōu)方案，即采用小劑量長療程，控制總量的方法，可有效預(yù)防瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)，與Yamawaki等[14]的報道一致。

綜上，對于瘢痕疙瘩術(shù)后淺層電子線照射的分割劑量，分次及總劑量等與多種因素有關(guān)。臨床上運用放射治療瘢痕疙瘩取得了一定的療效。在瘢痕疙瘩治療細(xì)節(jié)方面，對不同位置照射的時間間隔和劑量上仍然沒有達成共識。因此建立統(tǒng)一的術(shù)后淺層電子線照射標(biāo)準(zhǔn)，不斷提高其治療效果，尚需做大量的基礎(chǔ)和臨床研究。

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[收稿日期]2018-01-20 [修回日期]2018-04-25

編輯/李陽利