歐陽(yáng)紅梅，高玉紅，楊必清，陸興熱，蔣雅先，楊同華

(1.云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650032；2.云南省德宏傣族景頗族自治州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南芒市 678400；3.云南省文山壯族苗族自治州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南文山 663000；4.云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，昆明 650032)

珠蛋白生成障礙性貧血是人類最常見且危害最大的單基因遺傳病之一。2006年資料顯示，云南省珠蛋白生成障礙性貧血發(fā)病率居全球之首[1]，以邊境少數(shù)民族為高發(fā)人群。2011-2013年調(diào)查顯示云南邊境地區(qū)珠蛋白生成障礙性貧血檢出率相對(duì)更高占20.9%，尤以德宏州居首(人群檢出率43.1%)[2-3]，所以目前珠蛋白生成障礙性貧血仍是云南省特別是邊境少數(shù)民族地區(qū)危害較重的地方病。α-珠蛋白生成障礙性貧血是由于α-珠蛋白基因缺失或非缺失突變使α-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的遺傳性溶血性貧血。由于珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶率存在明顯的地域差異，本研究旨在初步了解云南少數(shù)民族地區(qū)新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶特征，為云南α-珠蛋白生成障礙性貧血三級(jí)預(yù)防提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)收集文山壯族苗族自治州(簡(jiǎn)稱文山州)、德宏傣族景頗族自治州(簡(jiǎn)稱德宏州)2016年11月至2017年3月出生的新生兒(年齡1～28 d)足跟血的干血斑210例(其中非漢族131 例、漢族79例；乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝血198例，其中非漢族121例，漢族77例。孕周為35～40周，2～8 ℃冷藏保存，7～15 d內(nèi)冷藏運(yùn)輸至云南省第一人民醫(yī)院完成檢測(cè)。家屬簽署知情同意書，登記受檢者姓名、編號(hào)、年齡、性別，民族、孕周及其父母的相關(guān)信息。民族分布情況見表1。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀(法國(guó)Sebia Capillarys Neonat Fast及Capillarys Flex Piercing)， PCR儀T100 Thermal Cycler、水平電泳儀Mini-Sub Cell GT、凝膠成像儀GelDoc EZ、熒光定量PCR儀CFX96 Touch、熔解曲線突變分析軟件CFX Manager3.1(美國(guó)Bio-rad),X1R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher)，ND-1000 型紫外分光光度計(jì)(NanoDrop 公司)。

1.2.2試劑 毛細(xì)管電泳儀質(zhì)控品及所用檢測(cè)試劑均為Sebia公司配套的珠蛋白生成障礙性貧血檢測(cè)試劑盒。磁珠法DNA提取試劑盒(UPure Blood DNA Extraction試劑盒2.0、UPure Swab DNA試劑盒，成都新百基)，常見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)試劑盒(廣州達(dá)安基因有限公司)，常見非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)試劑盒(廈門致善生物科技有限公司產(chǎn)品)。

1.3方法

1.3.1毛細(xì)管血紅蛋白(Hb)電泳 按照儀器操作規(guī)程完成質(zhì)控標(biāo)本、新生兒干血斑及抗凝血標(biāo)本毛細(xì)管Hb電泳檢測(cè)，記錄HbBart′s水平。

1.3.2分子生物學(xué)

1.3.2.1DNA提取及測(cè)定 使用成都新百基UPure Blood DNA Extraction試劑盒2.0及UPure Swab DNA試劑盒磁珠法提取新生兒抗凝全血、干血斑中DNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度，DNA樣本的A260 nm/A280 nm應(yīng)在1.6～2.0范圍之間，且A260 nm/A230 nm≥2.0 (若A260 nm/A230 nm<2.0，需要使用試劑盒中提供的DNA溶解液將DNA標(biāo)本進(jìn)行適度稀釋，但需保證樣本濃度大于1 ng/μL)。DNA記錄濃度后放置在-20 ℃冰箱備用。

1.3.2.2跨越裂隙PCR(gap-PCR) 檢測(cè)3種常見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因(--SEA-αα、-α3.7-αα、-α4.2-αα)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判讀。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min；隨后94 ℃ 45 s，62 ℃ 90 s，72 ℃ 2 min，共5個(gè)循環(huán)；然后94 ℃ 30 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 7 min。陰性質(zhì)控應(yīng)無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物，正常個(gè)體及正常質(zhì)控僅在1.8 kb處有1個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物、陽(yáng)性質(zhì)控在1.8、1.3 kb處有擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3.2.3熒光定量PCR熔解曲線法 檢測(cè)3種常見非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因(αCSα/、αQSα/ 和αWSα/)。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ UNG酶處理2 min，95 ℃ 10 min；隨后95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s(每個(gè)循環(huán)下降1 ℃)，76 ℃ 20 s，共10個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，76 ℃ 20 s，共50個(gè)循環(huán)；最后，95 ℃ 1 min，35 ℃ 3 min。設(shè)置溶解曲線分析程序：40～80 ℃，此階段每0.4 ℃采集1次FAM、HEX和ROX通道熒光信號(hào)。

1.3.2.4罕見突變檢測(cè) 對(duì)Hb電泳HbBart′s≥0.1%且未檢出常見α-珠蛋白生成障礙性貧血基因缺失及非缺失標(biāo)本，再行4種罕見缺失型 --THAI/αα，--FIL/αα，--MED/αα，-α20.5/αα多重PCR檢測(cè)。參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)引物，引物序列見表2。PCR 反應(yīng)體系包括：5 μL 2×GC buffer Ⅰ、250 μmol/L dNTP、正反向引物各0.16 μmol/L、Taq DNA 聚合酶0.5 U、15～25 ng

表1 文山及德宏兩地區(qū)民族構(gòu)成分布情況[n(%)]

-:此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)

基因組DNA模板。PCR反應(yīng)條件：96 ℃ 15 min；隨后98 ℃ 45 s，60 ℃ 90 s，保存或立即用2%瓊脂糖凝膠電泳。對(duì)以上罕見缺失檢測(cè)陰性的樣本進(jìn)行α1-珠蛋白基因和α2-珠蛋白基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。從UCSC 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.ucsc.edu)中獲取α-珠蛋白基因(α1-和α2-基因)的DNA序列。引物參照文獻(xiàn)[5]，分別擴(kuò)增α1-和α2-珠蛋白基因(包含3個(gè)外顯子及部分上游和下游序列)，引物委托生工生物工程(上海)有限公司合成。引物序列見表3。PCR 擴(kuò)增：α1-和α2-珠蛋白基因的PCR反應(yīng)體系相同，總體積為50 μL(包括：25 μL 2×GC buffer Ⅰ、750 μmol/L dNTP、正反向引物各6.4 pmol/L、Taq DNA聚合酶2.0 U、100 ng基因組DNA模板)。擴(kuò)增α1-珠蛋白基因的PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min;隨后95 ℃ 40 s，62.5 ℃ 40s，72 ℃ 100 s，共35個(gè)循環(huán)；然后72 ℃ 3 min；4 ℃保存。擴(kuò)增α2-珠蛋白基因的PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；隨后95 ℃ 40 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 100 s，共35個(gè)循環(huán)；然后72 ℃ 3 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增完成后，先取2～3 μL產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，確定成功擴(kuò)增并獲得特異性片段，將剩余PCR產(chǎn)物用于DNA測(cè)序。測(cè)序過(guò)程委托生工生物工程(上海)有限公司完成。用chromas 及clustalx 軟件分析DNA測(cè)序結(jié)果。

表2 罕見缺失型 --THAI/αα，--FIL/αα，--MED/αα， -α20.5/αα引物序列

表3 α1-和α2-珠蛋白基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1常見α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè) 對(duì)文山州210例、德宏州198例新生兒標(biāo)本行g(shù)ap-PCR、熒光定量PCR熔解曲線法檢測(cè)3種常見缺失型和非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因(--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα、αCSα/αα、αQSα/αα和αWSα/αα)，文山州檢出8例，其中--SEA/αα缺失4例(圖1)，-α3.7/αα缺失4例；德宏州檢出7例，其中-α3.7/αα缺失5例(圖2)，αCSα/突變2例(圖3)。

M：DNA分子標(biāo)記物；-：陰性對(duì)照；+:陽(yáng)性質(zhì)控品；11：--SEA/αα缺失

圖1 gap- PCR基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

M：DNA分子標(biāo)記物；D53：-α3.7/αα缺失

圖2 gap- PCR基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖3 熒光定量PCR熔解曲線法檢測(cè)αCSα/突變(陽(yáng)性)

2.2罕見α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè) 文山州新生兒標(biāo)本中檢出Hb Bart′s帶17例，德宏州檢出HbBart′s帶14例，其中11例檢出常見缺失型和非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因，對(duì)其余20例標(biāo)本行罕見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因(--THAI/αα，--FIL/αα，--MED/αα，-α20.5/αα)檢測(cè)。文山州檢出--FIL/αα缺失5例，德宏州--FIL/αα缺失7例，見圖4。對(duì)罕見缺失檢測(cè)陰性的8例標(biāo)本行PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序分析α1-和α2-珠蛋白基因的全長(zhǎng)，其α1-珠蛋白基因測(cè)序均為正?；颍?-珠蛋白基因基因均發(fā)現(xiàn)在5′UTR區(qū)位于基因第8個(gè)氨基酸，第24個(gè)堿基存在由G>C的同譯突變。文山州罕見非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變?chǔ)力?αTα 6例，德宏州αα/αTα罕見突變2例。

紅色箭頭所指為--FIL/αα罕見缺失

圖4多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3兩少數(shù)民族地區(qū)新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血的攜帶率及基因型

2.3.1文山州 文山州210例新生兒標(biāo)本中，檢出α-珠蛋白生成障礙性貧血基因19例，α-珠蛋白生成障礙性貧血攜帶率占9.0%(19/210)，基因型4種，其中罕見非缺失突變?chǔ)力?αTα 6例,構(gòu)成比31.6%(6/19)，攜帶率2.85%(6/210)，罕見缺失--FIL/αα 5例,構(gòu)成比26.3%(5/19)，攜帶率2.38%(5/210)，兩種常見缺失-α3.7/αα及--SEA/αα均為4例，構(gòu)成比21.05%(4/19)，攜帶率1.90(4/210)，未檢出常見-α4.2/αα缺失及3種常見突變。見表4、5。

表4 云南少數(shù)民族地區(qū)α-珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶率[n(%)]

2.3.2德宏州 德宏州198例新生兒標(biāo)本中，檢出α-珠蛋白生成障礙性貧血基因16例，α-珠蛋白生成障礙性貧血的攜帶率8.1%(16/198)，基因型4種，其中罕見缺失--FIL/αα缺失7例，構(gòu)成比43.7%(7/16)，攜帶率3.54%(7/198)，常見-α3.7/αα缺失5例，構(gòu)成比31.3%(5/16)，攜帶率2.53%(5/198)，常見αCSα/αα突變及罕見非缺失突變?chǔ)力?αTα均2例，構(gòu)成比12.5%(2/16)，攜帶率1.01%(2/198)，未檢出常見-α4.2/αα及αα/--SEA缺失。見表4、5。

表5 云南少數(shù)民族地區(qū)α-珠蛋白生成障礙性貧血基因型構(gòu)成比[n(%)]

-：此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)

3 討 論

α-珠蛋白生成障礙性貧血基因位于染色體16p13，每條染色體上有兩個(gè)連鎖的α-珠蛋白基因α1-和α2-，分別長(zhǎng)約1 kb，共4個(gè)，正常人以αα/αα表示。α-珠蛋白生成障礙性貧血可分為缺失型和非缺失型。缺失型是由于缺失染色體上1個(gè)(-α)或2個(gè)(--)α-珠蛋白基因；非缺失型是由于染色體上α1珠蛋白基因(ααT)或α2珠蛋白基因(αTα)發(fā)生突變。

全球已報(bào)道的缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血超過(guò)20種，世界上不同種族其α-珠蛋白基因缺失譜不同。報(bào)道的中國(guó)人缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血有14種，其中常見的缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血是東南亞缺失型(--SEA/αα)、右側(cè)缺失型(-α3.7/αα)、左側(cè)缺失型(-α4.2/αα)[6-7]。罕見缺失型分別是泰國(guó)缺失型(--THAI/αα)、菲律賓缺失型(--FIL/αα、--HW/αα、--FZ/αα、--11.1/αα、-α2.7、-α2.4、-α2.8、-α21.9、-α27.6、-α28.5)[8-12]。目前中國(guó)報(bào)道的非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血有13種，較常見的有HbConstant Spring(Hb CS，CD142 TAA→CAA)、Hb Quong Sze(HbQS， CD125 CTG→CGG)、Hb Westmead (Hb WS，CD122CAC→CAG)。臨床工作中，檢測(cè)3種常見缺失型基因(--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα)及3種常見非缺失型基因(αCSα、αQSα及αWSα)，就能檢出約98% α -珠蛋白生成障礙性貧血基因。

本研究采用gap-PCR、熒光定量PCR熔解曲線法對(duì)文山州210例、德宏州198例新生兒標(biāo)本檢測(cè)3種常見缺失型和非缺失型αα-珠蛋白生成障礙性貧血基因 (--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα、αCSα/αα、αQSα/αα 和αWSα/αα)，檢出α-珠蛋白生成障礙性貧血基因15例，其中文山州8例、德宏州7例；有4例(3例-α3.7/αα，1例ααCSα)α-珠蛋白生成障礙性貧血陽(yáng)性標(biāo)本在毛細(xì)管電泳儀上無(wú)HbBart′s帶檢出，提示采用毛細(xì)管電泳法檢測(cè)HbBart′s帶用于篩查新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血存在漏檢靜止型α-珠蛋白生成障礙性貧血。

兩地區(qū)共檢測(cè)出HbBart′s帶陽(yáng)性(HbBart′s帶大于或等于0.1%)標(biāo)本31例，其中檢出常見缺失及突變基因型為11例，其余20例標(biāo)本再行罕見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因(--THAI/αα，--FIL/αα，--MED/αα，-α20.5/αα)檢測(cè)及珠蛋白基因測(cè)序分析。結(jié)果顯示檢出罕見--FIL/αα缺失12例，罕見缺失均陰性的8例，并對(duì)8例PCR產(chǎn)物檢測(cè)α1-和α2-珠蛋白基因的全長(zhǎng)，α2-珠蛋白基因均為正?；?，α2-珠蛋白基因均發(fā)現(xiàn)在基因的5′UTR區(qū)位于基因第8個(gè)氨基酸，第24個(gè)堿基存在由G>C的同譯突變。該突變屬于已知突變，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為rs71382271，該突變不位于蛋白編碼區(qū)，但可能影響該基因的表達(dá)。即檢出罕見α2-珠蛋白基因突變?chǔ)力?αTα 8例。

本研究顯示文山州210例新生兒標(biāo)本中，壯族59例，占28.1%，彝族41例，占19.5%，為該研究群體中比例較高前兩位，其α-珠蛋白生成障礙性貧血的攜帶率為9.0%。德宏州198例新生兒標(biāo)本中，傣族66例，占33.3%，景頗族27例，占13.6%，為該研究群體中比例較高前兩位，其α-珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶率8.1%，表明云南兩少數(shù)民族新生兒群α-地貧基因攜帶率與2015年HUANG等[13]報(bào)道的云南α-珠蛋白生成障礙性貧血的攜帶率9.7%相近。目前研究顯示國(guó)內(nèi)α-珠蛋白生成障礙性貧血基因型是以-α3.7/αα及--SEA/αα為前兩位，并以地域差異兩者位次有所不同[14]。本研究顯示兩少數(shù)民族新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血基因型構(gòu)成比文山以罕見突變?chǔ)力?αTα、--FIL/αα缺失(構(gòu)成比分別為31.6%、26.3%)、德宏州以--FIL/αα和-α3.7/αα缺失(構(gòu)成比分別為43.7%、31.3%)為前兩位。提示云南兩少數(shù)民族地區(qū)α-珠蛋白生成障礙性貧血基因型有其獨(dú)特構(gòu)成比。

--FIL/αα缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血是1988年由FISCHEL等[15]發(fā)現(xiàn)，迄今為止，僅在中國(guó)臺(tái)灣、菲律賓人群中檢出--FIL/αα[16-17]，中國(guó)大陸僅2017年黎永鑒等[18]報(bào)道在廣西壯族自治區(qū)梧州市檢出1例--FIL/αα缺失。本次研究發(fā)現(xiàn)多例罕見--FIL/αα缺失，且以較高比例存在于云南兩少數(shù)民族新生兒群體中，與2017年楊陽(yáng)等[19]報(bào)道云南省α-珠蛋白生成障礙性貧血等位基因構(gòu)成比及其他文獻(xiàn)[20]報(bào)道中國(guó)南方各個(gè)地區(qū)等位基因構(gòu)成比均存在明顯差別。

綜上所述，本研究顯示云南省文山州及德宏州兩少數(shù)民族地區(qū)新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶率與文獻(xiàn)報(bào)道相符，約10%；首次在中國(guó)大陸檢出多例罕見α-珠蛋白生成障礙性貧血基因---FIL/αα缺失型，并以較高構(gòu)成比存在于云南省文山州及德宏州兩少數(shù)民族地區(qū)新生兒群體中，提示云南少數(shù)民族地區(qū)α-珠蛋白生成障礙性貧血基因型有其獨(dú)特構(gòu)成比，為下一步制訂云南少數(shù)民族地區(qū)α-珠蛋白生成障礙性貧血基因篩查及三級(jí)預(yù)防措施提供了科學(xué)依據(jù)。