佘巍巍，馬禮兵，羅 淼，林武洲，趙海金

(1.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥科/桂林醫(yī)學院呼吸疾病研究所，廣西桂林 541001；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院呼吸和危重癥科/慢性氣道疾病研究室,廣州，510515)

神經(jīng)生長因子(NGF)與過敏性和炎性疾病有關(guān)，在哮喘的病理生理學中起著重要的作用[1]。已有文獻報道了抗NGF與支氣管哮喘病理改變的關(guān)系，如網(wǎng)狀基底膜的厚度、膠原蛋白厚度、氣道壁厚度和NGF mRNA表達的關(guān)系[2-3]。然而，抗NGF在哮喘患者中的應用仍存在一定的困難。例如，關(guān)于抗NGF的具體機制及其藥理作用尚不清楚。此外，抗NGF的短靜脈半衰期，用藥后的快速稀釋和代謝，體內(nèi)NGF抗體的中和作用都會影響其療效。肺部因與外界相通且易于霧化吸入這一特殊的生理結(jié)構(gòu)故常適合于醫(yī)學上將其作為局部用藥的給藥部位,但對肺內(nèi)霧化吸入緩釋微球這一方法在肺部局部用藥治療疾病方面優(yōu)越性，這些目前尚缺乏更多的報道[4]。因此，本研究采用免疫組織化學法觀察霧化吸入抗NGF緩釋微球(NGFM)對哮喘小鼠NGF表達的影響，并為哮喘的發(fā)病機制和治療提供了新的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雌性體健的8～10周齡BALB/c小鼠40只，由桂林醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2儀器與試劑 牛血清清蛋白 (BSA，杭州四季青生物工程材料有限公司)； 抗鼠NGF 抗體(美國Sigma)；Masson染色試劑盒(福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)；羊抗鼠IgG、免疫組織化學染色(SABC)試劑盒及辣根過氧化物酶顯色劑(武漢博士德生物工程有限公司)；小鼠霧化吸入箱(自制)。

1.3方法

1.3.1抗NGFM的制備 用改進的高分子合金方法[5]制備抗NGFM。300 μg鼠抗-NGF抗體用0.5 mL含10 mg的BSA溶液混合。冷凍干燥條件：預凍溫度50 ℃，以20 ℃/min的速率降溫，其次將20 ℃孵化 3 h和20 ℃孵化12 h冷凍干燥處理后的凍干抗NGF粉均勻地分散在BSA矩陣中。將約300 mg的聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)按質(zhì)量比1∶3添加到一個試管中，將所制備的凍干抗NGF粉取出。然后將聚合物溶解在2 mL二氯甲烷形成的油相中，10 mL 2%的聚乙烯醇作為水相,水相加入油相，1 700 r/min 磁攪拌30 s，產(chǎn)生S/O/W型乳液，S/O/W型乳液轉(zhuǎn)移至400 mL 10%氯化鈉去離子水溶液中。室溫下1 700 r/min 磁攪拌30 s。制備成256.7 mg抗NGFM，于4 ℃保存，用于后續(xù)實驗。

1.3.2動物建模和分組 小鼠分為4組：對照組、哮喘組、抗NGF組和抗NGFM組，每組10只。除對照組外各組均于第 1、7天腹腔注射含卵清蛋白(OVA)的致敏液0.5 mL[含50 μg OVA和2 mg Al(OH)3混合液]腹腔注射致敏。然后抗NGF組:第15天起小鼠采用1% OVA約10 mL進行反復霧化吸入激發(fā)小鼠,每次霧化30 min,隔天1次,持續(xù)至第72天,并同時分別于以抗NGF抗體(4 mL/kg)腹腔內(nèi)注射(隔天1次),觀察小鼠癥狀,于最后一次腹腔注射抗NGF抗體后測定氣道反應性?？筃GF微球組：于第15天開始小鼠采用1% 10 mL OVA進行反復霧化吸入激發(fā)小鼠,每次霧化30 min,隔天1次,持續(xù)至第72天,并同時分別于以抗NGFM霧化吸入治療(每次霧化30 min,隔天1次)。對照組則參照相同的方案第1和7天腹腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS)，第15天給予PBS霧化，每次30 min，隔天1次，持續(xù)至第72天。以上各組在第72天的24 h內(nèi)處死小鼠，取肺組織作后續(xù)分析。

1.3.3肺功能測試 麻醉小鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛。采用全身體積描記系統(tǒng)(美國Buxco電子有限公司)進行肺功能測試，先記錄基線時的跨肺壓、肺流量、潮氣量等，隨后記錄吸入各組胺濃度后的(組胺霧化20 s以后)跨肺壓、肺流量和潮氣量等，計算出氣道肺阻力和動態(tài)肺順應性，氣道反應性是用氣道肺阻力和動態(tài)肺順應性來表現(xiàn)。

1.3.4組織學檢查 對支氣管網(wǎng)狀基底膜厚度的組織學檢查，在切片距離200 μm分隔處的兩個位置分別取出標體，在100 μm區(qū)間內(nèi)取3點作為樣本并記錄其支氣管黏膜網(wǎng)狀基底膜厚度，以這3點樣本的平均值做為網(wǎng)狀基底膜厚度。用千分尺放大(×1 000)并從基底的支氣管上皮下的網(wǎng)狀層的外邊緣厚度測量。使用計算機圖像分析軟件來測定平滑肌層、網(wǎng)狀基底膜層厚度和氣道壁的內(nèi)外徑。

1.3.5SABC免疫組織化學法檢測NGF蛋白表達 將標本放入4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片，采用SABA免疫組織化學法，一抗稀釋比為1：50，顯色后中性樹膠封片,參照經(jīng)典方法[8-9]，記錄NGF陽性反應區(qū)。

1.3.6病理染色 從右側(cè)主支氣管開口和從中、下支氣管各取3個標本來進行活組織檢查。經(jīng)100 mg的苯巴比妥腹腔注射麻醉后，所有大鼠均行開胸手術(shù)。HE染色：肺組織5 μm石蠟切片，59 ℃烤箱熔蠟，二甲苯透明30 min，梯度乙醇脫水約10 min，蘇木素染色約10 min，隨后鹽酸分化2 s，給予快速伊紅染色，再梯度乙醇脫水，最后干燥行中性樹膠并且封片。Massion 染色：肺組織5 μm石蠟切片，水洗后行蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，1%酸性品紅液染色，給予1%磷鋁酸水溶液浸染，再行冰乙酸分化；然后給予苯胺藍溶液染色，1%冰醋酸液進行分色，隨后用95%乙醇、無水乙醇進行脫水；二甲苯透明，中性樹膠進行封片。AB-PBS染色：肺組織5 μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，3%乙酸液洗2 min,加入1%阿利新蘭醋酸液10～20 min，蒸餾水沖洗，0.5%過碘酸水溶液浸染5 min；然后蒸餾水沖洗,70%乙醇沖洗；Schiff液浸染15～30 min；流水沖洗10 min；蘇木素淡染2～3 min,水洗；常規(guī)脫水、封片。觀察左側(cè)主支氣管及其周圍3個大血管的炎性細胞浸潤程度，并得到平均值。采用光筆來描寫平滑內(nèi)外邊界及氣道基底膜的周長。檢測基底膜的周長(BM)及平滑肌的面積(AM)，并計算平滑肌的肌肉厚度為(μm)。

圖1各組小鼠肺組織的病理圖片(×400)

1.3.7RT-PCR檢測 從活檢組織中分離出總RNA，并反向轉(zhuǎn)錄為cDNA。 用RT-PCR檢測NGF表達，以GAPDH作為內(nèi)部控制。NGF正向引物5′-ATC CAC CCA CCC AGT CTT CCA CAT-3′， 反向引物5′-GGC AGC CTG TTT GTC GTC TGT TGT-3′;GAPDH正向引物5′-CCT CTG GAA AGC TGT GGC GT-3′，反向引物5′-TTG GAG GCC ATG TAG GCC AT-3′，反應條件：95 ℃變性5 min；95 ℃變性5 s，55 ℃退火5 s，72 ℃擴展15 s，40個循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1動物行為學及肺組織病理學 HE染色：哮喘組可見血管旁和呼吸道周圍有許多的淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等炎性細胞浸潤，并且平滑肌層和黏膜下層增厚,氣道的管腔明顯狹窄；抗NGF組、抗NGFM組均較哮喘組氣道重塑情況有明顯減輕。Masson染色:哮喘組的膠原沉積多存在于氣道上皮下和血管壁處，并有顯著的增加現(xiàn)象,少量膠原沉積存在于肺泡間隔、小葉間及血管周圍的結(jié)締組織中；抗NGF組和抗NGFM組均較哮喘組有顯著的減弱。AB-PAS染色:哮喘組可見AB-PAS陽性信號面積在氣管上皮內(nèi)有顯著的增加,黏液杯狀細胞增生?？筃GF組、抗NGFM組均較哮喘組黏液細胞增生減輕，見圖1。在哮喘組，可見雙側(cè)鼻流鼻涕、呼吸急促和喘息。安靜時，抗NGF組和抗NGFM組出現(xiàn)了輕微的癥狀。根據(jù)病理改變的程度，按嚴重程度依次為哮喘組>抗NGF組>抗NGFM組。

表1 NGF激發(fā)前、后小鼠平均氣道阻力

組別n激發(fā)前激發(fā)后對照組100.18±0.0020.18±0.002哮喘組100.28±0.0010.37±0.031a抗NGF組100.25±0.0030.31±0.01ab抗NGFM組100.21±0.0020.24±0.02ac

a：P<0.05，與激發(fā)前比較;b：P<0.05,與哮喘組比較;c：P<0.05，與抗NGF組比較

2.2小鼠肺功能測試顯示 NGF激發(fā)后在平均氣道阻力方面，哮喘組>抗NGF組>抗NGFM組>對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。在肺順應性方面，對照組的動態(tài)肺順應性值在激發(fā)前、后無明顯差異。在NGF激發(fā)后對照組>抗NGFM組>抗NGF組>哮喘組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 NGF激發(fā)前、后小鼠的平均動態(tài)肺順應性

組別n激發(fā)前激發(fā)后對照組100.90±0.010.90±0.02哮喘組100.43±0.010.37±0.02a抗NGF組100.58±0.010.41±0.02ab抗NGFM組100.71±0.010.69±0.02abc

a：P<0.05，與激發(fā)前比較;b：P<0.05，與哮喘組比較;c：P<0.05，與抗NGF組比較

2.3網(wǎng)狀基底膜厚度、膠原蛋白厚度及氣道壁厚度 各組在小鼠肺組織網(wǎng)狀基底膜厚度、膠原蛋白厚度及氣道壁厚度比較可見抗NGFM組<抗NGF組<哮喘組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 網(wǎng)狀基底膜厚度、膠原蛋白厚度、氣道壁厚的比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05,與抗-NGF組比較;c：P<0.05，與哮喘組比較

2.4肺組織中NGF蛋白及mRNA的表達 表4顯示了各組肺組織中NGF蛋白和NGF mRNA的平均灰度值。NGF蛋白及mRNA均為哮喘組>抗-NGF組>抗-NGFM組>對照組，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 4組小鼠的NGF蛋白表達與NGF mRNA的平均灰度值比較

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05，與哮喘組比較；c：P<0.05，抗NGF組比較

3 討 論

最近的研究表明，抗NGF可能會拮抗過敏性哮喘的氣道高反應性。哮喘可以誘導肺組織的NGF過度表達[3,6]，NGF過度表達可能與哮喘發(fā)病機制中涉及的其他致病因素協(xié)同配合，誘發(fā)關(guān)鍵性肺損傷[2]。 NGF在哮喘[7]中起著“粘結(jié)”作用，合理的抗NGF調(diào)節(jié)可以有效地減少氣道哮喘及肺組織的NGF過度表達[6]，抑制氣道重塑和炎癥[3]，從而延緩甚至逆轉(zhuǎn)哮喘的進程。在本研究中，霧化吸入后的抗NGFM能附著在受損氣道內(nèi)的內(nèi)皮外露神經(jīng)末梢，導致神經(jīng)末梢和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的持續(xù)抑制，從而達到控制哮喘氣道炎癥的目的。

在肺功能測試中發(fā)現(xiàn)，氣道流速的大小、氣道阻力程度、動態(tài)肺順應性值在抗NGFM組中均有明顯抑制，提示抗NGFM可降低氣道流速，改善氣道阻力及動態(tài)順應性，局部霧化吸入抗NGFM是較好的藥物管理途徑。本研究中在網(wǎng)狀基底膜厚度、膠原厚度和氣道壁厚度方面抗-NGFM和抗-NGF之間的差異明顯,表明霧化吸入抗-NGFM可以顯著抑制網(wǎng)狀基底膜厚度、膠原蛋白沉積、哮喘氣道炎癥和氣道壁厚度?？筃GF組與抗NGFM組之間的差異有統(tǒng)計學意義，提示腹腔內(nèi)注射不能集中藥物于肺內(nèi)，可能會拮抗NGF在神經(jīng)系統(tǒng)和其他器官的正常功能需要。

本研究顯示NGF mRNA和NGF蛋白質(zhì)在抗NGFM組中的表達明顯低于抗NGF組，這提示與腹腔注射比較，霧化吸入治療可更有效地減少NGF表達。基于以往的研究[3,8-9]，抗NGF干預可拮抗氣道高反應性和氣道炎癥，從而減少NGF的分泌，當抗NGF藥物制成微球后，其對肺組織有親和力，并選擇性地將藥物直接靶向相應部位。微球可以準確地遞送到所需的部位，以連續(xù)或脈沖的方式釋放活性蛋白，避免由于重復使用生物半衰期短的藥物而給患者帶來不便[10]。美國食品和藥物管理局已批準微球配方作為人體的載體材料[11]。王世壽等[12]提出：肺部微球因載體材料的釋藥性能而具有緩釋性，并因常用的材料有淀粉、聚乳酸等，具有生物可降解性、生物相容性和生物黏附性，故具有安全性,同時因微球在肺內(nèi)局部作用故具有良好肺內(nèi)靶向性，可提高藥物的療效。因此，如果抗NGFM可用于臨床治療哮喘，其可能會提供更好的治療效果。然而，抗NGFM在人類身上的安全性和有效性還需要進一步研究。

總之,霧化吸入抗NGFM的治療改善了哮喘小鼠肺的行為和病理變化，提示該藥給予霧化吸入可能優(yōu)于腹腔注射。這可能是因為霧化吸入給藥可以增加局部血液的藥物濃度并超過藥物治療的閾值濃度，此外，緩釋微球是一種有效的控釋制劑，能提高穩(wěn)定性，降低機體損傷程度，具有良好的生物耐受性，使藥物集中在靶區(qū)。這些特點可以改善藥物治療的療效。