廖銘心，劉 瑤，蔡 僮，方 文

(貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院臨床生化教研室，貴陽(yáng) 550004)

宮頸癌是目前威脅女性健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，尤其對(duì)于發(fā)展中國(guó)家來(lái)說(shuō)其發(fā)病率更是居高不下[1]。據(jù)中國(guó)癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示我國(guó)宮頸癌的發(fā)病率和病死率分別為10.4/105和2.59/105[2]。在尋求改善傳統(tǒng)治療方案的同時(shí)探索在基因水平上新的腫瘤抑制方法受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。核內(nèi)不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1,hnRNP A2/B1) 是hnRNPs家族中的一員，與mRNA的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和多種腫瘤的發(fā)生(如胃癌、非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等)有著密切的聯(lián)系[3-6]。本課題組前期用洛鉑作用于宮頸癌細(xì)胞后也發(fā)現(xiàn)hnRNP A2/B1表達(dá)下調(diào)并有細(xì)胞周期阻滯和抑制增殖的現(xiàn)象[7]。而細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1與cyclin E聯(lián)合可促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1期的限制點(diǎn)，cyclin D1、cyclin E在調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程中起到重要作用[8]，同時(shí)JOHN等[9]和BUTT等[10]總結(jié)發(fā)現(xiàn)cyclin D1和cyclin E 在多種腫瘤中表達(dá)都上調(diào)進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)展。本課題組前期已通過(guò)慢病毒介導(dǎo)沉默宮頸癌Hela細(xì)胞中的hnRNP A2/B1基因表達(dá)[11-12]，本研究擬進(jìn)一步探討hnRNP A2/B1對(duì)細(xì)胞cyclin D1/E表達(dá)水平的影響并通過(guò)裸鼠移植瘤模型觀察沉默hnRNP A2/B1基因后對(duì)腫瘤生長(zhǎng)情況的影響，闡明hnRNP A2/B1對(duì)宮頸癌發(fā)展的重要作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 4～6周BALB/c雌性裸鼠共18只，購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)相關(guān)試劑RIPA裂解液、BCA試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)Biosystems公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司；兔抗hnRNP A2/B1抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，兔抗cyclin D1和兔抗cyclin E抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，兔抗β-actin、抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)及免抗Ki-67抗體購(gòu)自博奧森生物公司，辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購(gòu)自萬(wàn)類(lèi)生物公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2主要儀器 Allegra高速臺(tái)式低溫離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司；Bio-rad680全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、Western blot垂直電泳槽購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自日本三洋電機(jī)有限公司；Nikon-TE2000-U倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2方 法

1.2.1慢病毒轉(zhuǎn)染沉默hnRNP A2/B1 慢病毒介導(dǎo)shRNA轉(zhuǎn)染沉默宮頸癌Hela細(xì)胞株步驟詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11-12]。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌Hela細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。將未沉默細(xì)胞株和沉默后的細(xì)胞株共分3組：正常Hela細(xì)胞組、陰性沉默對(duì)照組 (Hela-NC 組)、陽(yáng)性沉默實(shí)驗(yàn)組 (Hela-shRNA組)。各組細(xì)胞分別用含有10%的胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素和1% L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液在37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換1次培養(yǎng)液。

1.2.3real-time PCR驗(yàn)證沉默效率 取上述3組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取總RNA并測(cè)定濃度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，每個(gè)樣品cDNA模板設(shè)立3個(gè)平行管。采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段。PCR引物如下：β-actin正向引物：5′-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3′，反向引物：5′-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A -3′； hnRNP A2/B1正向引物：5′-GAT GGC AGA GAA CGG TGT GAA G-3′， 反向引物：5′-AGG CAT AGG TAT TGG CAA CTG C-3′。PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃，10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40次循環(huán)。根據(jù)PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線分析產(chǎn)物的特異性，以β-actin為內(nèi)參，最終結(jié)果以2-△△Ct統(tǒng)計(jì)各組基因表達(dá)水平。

1.2.4Western blot 于冰上用含有1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞及移植瘤組織并在4 ℃離心機(jī)上以12 000 r/min離心20 min后收集上清蛋白液于-80 ℃保存?zhèn)溆?。BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液孵育2 h。然后4 ℃過(guò)夜孵育兔抗β-actin (1∶6 000)、兔抗cyclin D1 (1∶500)、兔抗cyclin E(1∶500)、兔抗hnRNPA2/B1(1∶500)一抗，之后用TBST洗3次，每次10 min，將PVDF膜在山羊抗兔二抗(1∶90 000)中室溫孵育1 h。ECL發(fā)光液顯影并曝光。用Image J軟件分析各組的灰度值。

1.2.5MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 用0.25% 的胰蛋白酶將Hela組、Hela-NC組及Hela-shRNA組的細(xì)胞消化下來(lái)并稀釋至5×104/mL，以每孔200 μL加入96孔板中并在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、48 h。然后每孔加入含10 μL MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后去除上清液并每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)于酶標(biāo)儀上充分震蕩10 min后在490 nm處檢測(cè)吸光度(A)值。

1.2.6構(gòu)建裸鼠移植瘤模型 于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)入18只4周齡的雌性BALB/c裸鼠并用清潔級(jí)飼料飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)動(dòng)物房中。實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)細(xì)胞分3組，每組6只裸鼠。每只裸鼠于右背靠頸部皮下接種200 μL懸浮細(xì)胞液 (2×106/mL細(xì)胞懸浮于200 μL PBS中)。之后每3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積大小并根據(jù)文獻(xiàn)中發(fā)表的公式計(jì)算體積[13]。腫瘤生長(zhǎng)30 d后用10%水合氯醛麻醉并斷頸處死裸鼠收集腫瘤組織。

1.2.7免疫組織化學(xué) 移植瘤組織取出后用4%的中性甲醛固定24 h，之后脫水、石蠟包埋并制成4 μm厚的切片粘貼于載玻片上。之后二甲苯化蠟，梯度乙醇脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原3 min。0.3% H2O2阻斷非特異性抗原30 min，PBST洗3次后用10%的血清封閉液封閉20 min。4 ℃過(guò)夜孵育兔抗PCNA (1∶100)和兔抗Ki-67(1∶100)一抗，并以PBS代替一抗處理切片作為陰性對(duì)照。一抗孵育完畢并復(fù)溫40 min后在37 ℃水浴箱中孵育二抗20 min，之后DAB顯色，蘇木素復(fù)染并逆行脫水后用中性樹(shù)脂封片。棕色區(qū)域視為陽(yáng)性區(qū)域，Image-Pro Plus6.0軟件分析各組組織中棕色區(qū)域的IOD值。

1.2.8蘇木素-伊紅(HE)染色 前期組織處理與免疫組織化學(xué)步驟類(lèi)似。4 μm厚的切片經(jīng)脫蠟和再水合后用蘇木素處理5 min，1%鹽酸乙醇分化1 s，伊紅染液處理3 min，逆行脫水后用中性樹(shù)脂封片。

2 結(jié) 果

2.1各組宮頸癌Hela細(xì)胞中hnRNP A2/B1基因表達(dá)情況比較 由慢病毒介導(dǎo)shRNA沉默hnRNP A2/B1基因的Hela-shRNA組與Hela組和Hela-NC組比較，hnRNA A2/B1表達(dá)降低(P<0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示Hela-shRNA組中的hnRNP A2/B1抑制效率達(dá)到(74.79±3.38)%，Western blot結(jié)果顯示Hela-shRNA組中hnRNP A2/B1蛋白的表達(dá)量相較于其他兩組明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A：hnRNP A2/B1 mRNA；B：hnRNP A2/B1蛋白；a：P<0.05，與Hela組及Hela-NC組比較

圖1慢病毒介導(dǎo)shRNA沉默hnRNP A2/B1基因

2.2沉默hnRNP A2/B1對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響 對(duì)Hela組、Hela-NC組及Hela-shRNA組分別檢測(cè)各自在12、24、48 h時(shí)間點(diǎn)的增殖情況。Hela-shRNA組在48 h時(shí)間點(diǎn)的增殖情況較Hela組及Hela-NC組明顯降低 (P<0.05)，見(jiàn)圖2。

a：P<0.05，與Hela組及Hela-NC組比較

圖2沉默hnRNP A2/B1后各組的增殖水平比較

2.3沉默hnRNP A2/B1后對(duì)體外細(xì)胞cyclin D1及cyclinE表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示Hela-shRNA組的cyclin D1及cyclin E蛋白水平相較于Hela組及Hela-NC組明顯降低(P<0.05)，Hela組與Hela-NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

2.4沉默hnRNP A2/B1后對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞移植瘤的影響 對(duì)于接種Hela、Hela-NC及Hela-shRNA的3組裸鼠，在實(shí)驗(yàn)期間各組行為都未見(jiàn)異常表現(xiàn)，飲食正常，各組存活率為100%。Hela-shRNA組的腫瘤生長(zhǎng)相較于另外兩組明顯受到抑制，腫瘤體積明顯減小 (P<0.05)，見(jiàn)圖4。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示Hela-shRNA組中的增殖相關(guān)抗原PCNA及Ki-67表達(dá)較其余兩組均明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5、6，HE染色見(jiàn)各組切片中腫瘤細(xì)胞的病理形態(tài)呈現(xiàn)出細(xì)胞核深染，大小不一，核質(zhì)比例失調(diào)，部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則的現(xiàn)象，但各組之間的形態(tài)并無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖6。另外移植瘤組織中的Western blot結(jié)果同樣顯示Hela-shRNA組的cyclin D1及cyclin E較其他兩組明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

A：Western blot;B:定量分析圖；a：P<0.05，與Hela組及Hela-NC組比較

圖3體外細(xì)胞中各組cyclin D1及cyclin E蛋白表達(dá)變化

a：P<0.05，與Hela組及Hela-NC組比較

圖4裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況

a：P<0.05，與Hela組及Hela-NC組比較

圖5免疫組織化學(xué)定量分析

圖6免疫組織化學(xué)及HE染色(×400)

A:Western blot;B:定量分析圖；a：P<0.05，與Hela組和Hela-NC組比較

圖7移植瘤組織中cyclin D1及cyclin E蛋白表達(dá)變化

3 討 論

由于宮頸癌在女性腫瘤的高發(fā)病率及惡性程度，目前許多學(xué)者都致力于尋找與宮頸癌相關(guān)的癌基因。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與諸多基因都有關(guān)聯(lián)，而hnRNP A2/B1基因與宮頸癌的聯(lián)系鮮有報(bào)道，因此本研究希望在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索hnRNP A2/B1對(duì)調(diào)控宮頸癌細(xì)胞中周期相關(guān)蛋白的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的影響。

hnRNP A2/B1是一組由hnRNP A2和hnRNP B1蛋白質(zhì)以適當(dāng)比例結(jié)合涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯的mRNA結(jié)合蛋白[3-4]。hnRNP A2/B1不受調(diào)控地在腫瘤組織中的高表達(dá)是促進(jìn)腫瘤形成的原因之一[6]，甚至有研究報(bào)道將hnRNP A2/B1定義為一種原癌基因，尤其是在非小細(xì)胞肺癌中，hnRNP A2/B1已作為其腫瘤生物標(biāo)記物及判斷預(yù)后的指標(biāo)[14]。LI等[15]研究發(fā)現(xiàn)hnRNP A2/B1及其他部分hnRNPs家族的基因參與介導(dǎo)人乳頭瘤病毒16型(HPV-16)感染宮頸上皮的過(guò)程，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)hnRNP A2/B1在宮頸癌中也是呈高表達(dá)狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示沉默宮頸癌細(xì)胞中hnRNP A2/B1后其增殖及腫瘤生長(zhǎng)等方面明顯受到抑制，這也印證了部分學(xué)者的結(jié)論，說(shuō)明hnRNP A2/B1確實(shí)參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

從體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示cyclin D1及cyclin E在hnRNP A2/B1基因沉默后均表達(dá)下調(diào)，而這兩種蛋白對(duì)于調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程至關(guān)重要[8]，這說(shuō)明hnRNP A2/B1有可能通過(guò)cyclin D1及cyclin E來(lái)調(diào)控宮頸癌中的細(xì)胞周期變化。趙向寨等[16]發(fā)現(xiàn)通過(guò)沉默hnRNPs家族中的 hnRNP H基因能夠下調(diào)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中的cyclin D1、CDK4的表達(dá)。而據(jù)CHOI等[17]報(bào)道，hnRNP A2/B1在維持人胚胎干細(xì)胞的自我更新及多功能性上具有重要意義，并通過(guò)沉默hnRNP A2/B1后也發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞中的cyclin D1及cyclin E及cyclin B1表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞周期阻滯于G1期。同時(shí)也有報(bào)道稱(chēng)在肺腺癌中檢測(cè)到hnRNP B1升高而cyclin D1減少，協(xié)同二者的結(jié)果對(duì)肺腺癌及不典型增生的診斷具有重要意義[18]。而上述結(jié)論與本研究結(jié)論相一致，由此可以推斷cyclin D1及cyclin E在hnRNP A2/B1調(diào)控宮頸癌細(xì)胞周期進(jìn)程中十分重要。細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原Ki-67及PCNA均為存在于細(xì)胞增殖期的蛋白質(zhì),是增殖細(xì)胞標(biāo)記物之一，常被用于許多腫瘤與非腫瘤組織通過(guò)免疫組織化學(xué)分析病理特性的標(biāo)記物[19]，對(duì)于這兩種蛋白質(zhì)的檢測(cè)有助于了解腫瘤細(xì)胞的增殖活性。本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示沉默hnRNP A2/B1后PCNA和Ki-67的表達(dá)均顯著減低，同時(shí)結(jié)合體外MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明hnRNP A2/B1能夠調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖活性。

綜上所述，本次通過(guò)沉默hnRNP A2/B1基因后對(duì)宮頸癌細(xì)胞體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究。結(jié)果顯示，hnRNP A2/B1在宮頸癌細(xì)胞中可能參與調(diào)控細(xì)胞增殖，并通過(guò)cyclin D1及cyclin E調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，同時(shí)促進(jìn)宮頸癌的生長(zhǎng)。所以hnRNP A2/B1可能是治療宮頸癌的一個(gè)基因靶點(diǎn)，這將為未來(lái)對(duì)治療宮頸癌進(jìn)一步研究提供一個(gè)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。