張?jiān)? 王晨 張斗勝 周從亞 楊麗 趙榮生 翟所迪 張現(xiàn)化

中圖分類號(hào) R969.1；R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）23-3193-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.06

摘 要 目的：建立測(cè)定犬血漿中阿莫西林濃度的方法，研究其藥動(dòng)學(xué)特征。方法：取12只比格犬，灌胃阿莫西林膠囊250 mg，分別于給藥前和給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、10 h取血1.0～1.5 mL，以阿莫西林-d4為內(nèi)標(biāo)，血漿樣品經(jīng)酸性乙腈沉淀后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測(cè)定其中阿莫西林的血藥濃度。色譜條件為色譜柱Waters Atlantis dC18，流動(dòng)相乙腈（含0.1%甲酸）-10 mmol/L甲酸銨水溶液（pH 4.5），采用梯度洗脫的方式，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量1 ?L；質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，正離子模式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，離子源噴霧電壓5.5 kV，離子源溫度450 ℃，霧化氣壓力30 psi，加熱氣壓力40 psi，阿莫西林離子對(duì)m/z 366.2→113.9，內(nèi)標(biāo)離子對(duì)m/z 370.2→353.0，二者碎裂電壓分別為26、16 V，駐留時(shí)間均為200 ms。結(jié)果：阿莫西林檢測(cè)質(zhì)量濃度在0.1～16 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.998 2），日內(nèi)、日間精密度的RSD分別小于14.3%、11.8%（n=5），準(zhǔn)確度為93.0%～112.0%（n=3）；提取回收率為58.9%～63.3%（RSD=3.3%，n=3），基質(zhì)效應(yīng)為2.8%（n=6），穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于15%（n=3）。阿莫西林在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)符合一室模型，t1/2為1.56 h、10 h內(nèi)的藥-時(shí)曲線下面積（AUC0-10 h）為24 300 ng·h/mL、cmax為7 523 ng/mL。結(jié)論：該方法靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，可用于犬血漿中阿莫西林的血藥濃度測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)的研究。

關(guān)鍵詞 阿莫西林；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；比格犬；血藥濃度

ABSTRACT OBJECTIVE： To develop the method for the determination of amoxicillin concentration in dog plasma， and to study its pharmacokinetic characteristics. METHODS： Totally 12 Beagle dogs were collected and given Amoxicillin capsules 250 mg intragastrically. The 1.0-1.5 mL plasma samples were collected before medication， and 0.5， 1， 1.5， 2， 2.5， 3， 3.5， 4， 4.5， 5， 5.5， 6， 8， 10 h after medication. Using amoxicillin-d4 as internal standard （IS）， after precipitated with acidic acetonitrile， the plasma concentration of amoxicillin was determined by LC-MS/MS. The separation was performed on an Atlantis dC18 column with mobile phase consisted of acetonitrile （containing 0.1% formic acid）-10 mmol/L ammonium formate water solution （pH 4.5， gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 1 ?L. Mass spectrum condition included ESI， positive ion mode， multiple reaction monitoring， ion source spray voltage 5.5 kV， ion source temperature 450 ℃， atomizing gas pressure 30 psi， heater pressure 40 psi， ion pair m/z 366.2→113.9 and m/z 370.2→353.0 for amoxicillin and IS， fragmentation voltage 26 and 16 V， residence time 200 ms. RESULTS： The linear range of amoxicillin was 0.1-16 μg/mL （r=0.998 2）. RSDs of intra-day and inter-day were lower than 14.3% and 11.8% （n=5）. The accuracy was 93.0%-112.0% （n=3）. The extraction recoveries were 58.9%-63.3% （RSD=3.3%， n=3）， and matrix effect was 2.8%（n=6）. RSDs of stability test was lower than 15% （n=3）. By single compartment model， the pharmacokinetic parameters of amoxicillin included that t1/2 was 1.56 h， AUC1-10 h was 24 300 ng·h/mL and cmax was 7 523 ng/mL. CONCLUSIONS： The method is sensitive， accurate， simple and rapid. It is applied for the determination of amoxicillin concentration in the plasma of dog and the pharmacokinetic study of amoxicillin.

KEYWORDS Amoxicillin； LC-MS/MS； Beagle dog； Plasma concentration

阿莫西林（Amoxicillin）是一種半合成廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物。在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，由于羥基和氨基的引入，阿莫西林具有很好的耐酸性，比一般青霉素更適合口服且抗菌譜更廣，應(yīng)用廣泛，但在臨床上可引起有多種不良反應(yīng)[1-4]。青霉素類制劑普遍存在副反應(yīng)，其中以阿莫西林的報(bào)道最多，因此必須嚴(yán)格控制其用量。由于阿莫西林分子中含有的β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，在水、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及青霉素酶等的作用下容易水解破裂，進(jìn)而失去活性，甚至聚合產(chǎn)生致敏性雜質(zhì)，導(dǎo)致人體產(chǎn)生嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。因此，在開(kāi)展仿制藥一致性評(píng)價(jià)之前，需對(duì)仿制藥的藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)及毒理學(xué)性質(zhì)進(jìn)行全面的評(píng)估。本研究參考已報(bào)道的阿莫西林血藥濃度的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法[5-10]，并加以改進(jìn)，建立了一種更加穩(wěn)定、樣本需要量更少的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），并考察將其用以研究阿莫西林在比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，以期為阿莫西林的質(zhì)量監(jiān)控提供一種新的檢測(cè)方法。

1 材料

1.1 儀器

液質(zhì)聯(lián)用儀，包括Shimadzu 20AD液相色譜儀（日本島津公司）；Sciex 5500 QTrap質(zhì)譜儀（美國(guó)Sciex公司）；MS3 digital渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）；BT25S電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；3-18K離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；Cascada-I純水機(jī)（美國(guó)Pall公司）。

1.2 藥品與試劑

阿莫西林對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：30409-201011，純度：85.8%）；阿莫西林-d4標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)，美國(guó)TRC公司，批號(hào)：7-YHH-23-1，純度：96.0%）；阿莫西林膠囊（中國(guó)某藥企提供，批號(hào)：01，規(guī)格：每粒250 mg）；乙腈、甲酸、醋酸銨以及甲酸銨均為色譜純。

1.3 動(dòng)物

比格犬，普通級(jí)，♀♂各6只，8～12月齡，體質(zhì)量為7.78～9.48 kg，來(lái)源于北京日新科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0004。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 溶劑 0.01 mol/L醋酸銨緩沖液（pH 4.5）-甲醇 （1 ∶ 1，V/V）溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱取阿莫西林對(duì)照品適量，用溶劑配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的對(duì)照品貯備液，再用溶劑稀釋制成所需質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 內(nèi)標(biāo)溶液 取阿莫西林-d4標(biāo)準(zhǔn)品，直接用溶劑溶解配制成質(zhì)量濃度為526.6 ?g/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液，再用溶劑稀釋成質(zhì)量濃度為52.66 ?g/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 樣品前處理

精密吸取100 μL血漿，置于1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液5 μL，渦旋混合后加入400 μL乙腈（含0.3%甲酸），渦旋1 min，4 ℃條件下15 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

2.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters Atlantis dC18（150 mm×2.1 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相A為乙腈溶液（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為10 mmol/L甲酸銨水溶液（pH 4.5），梯度洗脫（0～1.3 min，99%B；1.3～3 min，99%B→8%B；3～4 min，8%B；4～4.1 min，8%B→99%B；4.1～7 min，99%B）；流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為1 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI），以正離子模式、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描方式進(jìn)行定量。離子源電壓為5.5 kV，離子源溫度為450 ℃，霧化氣壓力為30 psi，加熱氣壓力為40 psi。阿莫西林離子對(duì)為m/z 366.2→113.9，碎裂電壓為26 V；內(nèi)標(biāo)離子對(duì)為m/z 370.2→353.0，碎裂電壓為16 V，駐留時(shí)間均為200 ms。

2.4 專屬性

取6只比格犬，分別取空白血漿各100 μL作為雙空白血漿樣品；另取空白血漿95 μL，分別加入溶劑5 μL作為單空白血漿樣品；再取空白血漿95 μL，加入阿莫西林對(duì)照品，制成0.1 μg/mL的含藥血漿樣品；以給藥后1 h的血漿樣品作為待測(cè)樣品，除雙空白血漿樣品不加入內(nèi)標(biāo)外，其余均按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，并與阿莫西林+內(nèi)標(biāo)溶液的色譜圖進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，阿莫西林與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間均為1.72 min左右，雙空白血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)于阿莫西林和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定均無(wú)干擾，單空白血漿樣本中內(nèi)標(biāo)對(duì)于阿莫西林的測(cè)定也無(wú)干擾。表明該色譜條件專屬性較好。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.5 線性關(guān)系與定量下限

取空白血漿95 μL，加入相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液，制備成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、16 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以阿莫西林與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（y）、阿莫西林的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行回歸分析，權(quán)重為1/x2。得回歸方程為y=0.00 035 x-0.000 375（r=0.998 2），阿莫西林的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.1～16 μg/mL，定量下限為0.1 μg/mL。

2.6 精密度與準(zhǔn)確度

取空白血漿95 μL，加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、2.5、8.0、12.0 μg/mL的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行配制5份，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，考察批內(nèi)精密度，并以測(cè)得值/真實(shí)值×100%計(jì)算批內(nèi)準(zhǔn)確度。同法在3 d內(nèi)配制并測(cè)定3批次樣品，考察批間精密度和批間準(zhǔn)確度。精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果見(jiàn)表1。

2.7 提取回收率

取空白血漿95 μL，加入阿莫西林對(duì)照品溶液制成質(zhì)量濃度分別為0.3、2.5、8.0、12.0 μg/mL的質(zhì)控樣品，加入400 μL乙腈（含0.3%甲酸）后，渦旋1 min，4 ℃條件下15 000 r/min離心5 min，取上清液，加入溶劑5 μL和內(nèi)標(biāo)溶液5 μL，渦旋混勻后吸取上清液進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算阿莫西林與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值A(chǔ)QC/AIS；另取空白血漿95 μL，加入溶劑5 μL，渦旋混勻后加入400 μL乙腈（含0.3%甲酸），渦旋1 min，4 ℃條件下15 000 r/min離心5 min，取上清液，加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的阿莫西林對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液制成同上濃度的樣品，渦旋混勻后吸取上清液進(jìn)樣分析，計(jì)算阿莫西林與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值A(chǔ)QC/AIS。以（AQC/AIS）/（AQC/AIS）×100%計(jì)算提取回收率，每個(gè)濃度平行做3份。結(jié)果顯示，0.3、2.5、8.0、12.0 μg/mL的質(zhì)控樣品的提取回收率分別為63.3%、60.8%、59.3%、58.9%，平均提取回收率為60.6%，RSD為3.3%（n=4）。說(shuō)明不同質(zhì)控水平提取回收率變異均較小。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)

分別取6只比格犬的空白血漿，各95 μL，加入溶劑5 μL，按“2.7”項(xiàng)下方法提取后，再加入0.3、12 ?g/mL質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液5 μL和內(nèi)標(biāo)溶液5 μL，渦旋混勻后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算阿莫西林與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值A(chǔ)QC/AIS；以純化水取代血漿，制備同上濃度的含阿莫西林和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤?，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算阿莫西林與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值 AQC/AIS，計(jì)算內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子（ISMF）=（AQC/AIS）/（AQC/AIS），并計(jì)算其RSD。結(jié)果顯示，在低、高濃度下，不同來(lái)源血漿中阿莫西林ISMF的RSD均為2.8%（n=6），符合2015年版《中國(guó)藥典》的要求。

2.9 稀釋效應(yīng)

配制100 μg/mL的血漿樣本，用空白血漿稀釋10倍后，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定5份，考察精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，峰面積的RSD為2.8%（n=5），準(zhǔn)確度為107.4%，表明血漿樣品經(jīng)10倍稀釋后，不影響其測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.10 穩(wěn)定性

2.10.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性 分別將阿莫西林貯備液（2 mg/mL）儲(chǔ)存于玻璃容器和塑料容器中，依次在室溫、4 ℃、-20 ℃條件下保存48 h、7 d、10 d、14 d，與新鮮配制的貯備液同時(shí)進(jìn)樣分析，平行測(cè)定3次，考察標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，阿莫西林室溫下穩(wěn)定性最差， -20 ℃凍存穩(wěn)定性最好；用塑料容器儲(chǔ)存降解速度低于玻璃容器。因此，本研究中標(biāo)準(zhǔn)溶液用塑料容器保存在-20 ℃條件下。樣品置于不同容器中的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.10.2 含藥血漿穩(wěn)定性 分別考察質(zhì)量濃度分別為0.3、12.0 ?g/mL的含藥血漿在室溫下放置25 h、-80 ℃反復(fù)凍融3次、-80 ℃下放置58 d以及處理后4 ℃下放置120 h的穩(wěn)定性，平行測(cè)定3次，考察準(zhǔn)確度和RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.11 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

取12只比格犬，♀♂各半，單劑量灌胃阿莫西林膠囊250 mg，分別于給藥前（0 h）和給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、10 h取前肢靜脈血1.0～1.5 mL，分別置于有抗凝劑的離心管中，混勻后3 500 r/min離心10 min，取上層血漿，加入到1.5 mL塑料離心管中，保存于-80 ℃下待測(cè)。按本文建立的方法測(cè)定血漿樣品中阿莫西林的濃度，根據(jù)其變化發(fā)現(xiàn)阿莫西林在比格犬體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和清除符合一室模型。計(jì)算阿莫西林在比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)t1/2為1.56 h，藥-時(shí)曲線下面積（AUC0-10 h）為24 300 ng·h/mL，cmax為7 523 ng/mL，表觀分布容積為0.023 L，清除率為0.010 L/h，tmax為1.5 h。犬體內(nèi)阿莫西林的藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖3。

3 討論

由于阿莫西林本身化學(xué)極性較大且穩(wěn)定性差，采用液液萃取法進(jìn)行前處理回收率非常低，因此本研究采用酸性乙腈沉淀蛋白后直接進(jìn)樣，操作簡(jiǎn)單、快速。由于蛋白沉淀后易存在基質(zhì)效應(yīng)影響[5]，本研究采用同位素內(nèi)標(biāo)阿莫西林-d4，其理化性質(zhì)與阿莫西林高度相似，可減小基質(zhì)效應(yīng)影響，提高方法的耐用性和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，由于阿莫西林結(jié)構(gòu)中含有四元環(huán)，穩(wěn)定性較差，因此，本研究對(duì)阿莫西林的穩(wěn)定性及保存條件進(jìn)行了較為深入的考察，最終選擇塑料容器保存標(biāo)準(zhǔn)溶液（-20 ℃）及血漿樣本（-80 ℃）。在樣本制備和測(cè)定過(guò)程中，另還需要嚴(yán)格控制pH，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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（收稿日期：2018-06-08 修回日期：2018-10-18）

（編輯：鄒麗娟）