李麗麗 楊林 謝鋒 辛艷飛 張升 陳嬌婷 宣堯仙 由振強

中圖分類號 R99；R979.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）23-3198-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.07

摘 要 目的：篩選大鼠體內(nèi)堿性彗星試驗中陽性藥環(huán)磷酰胺（CP）和甲基磺酸乙酯（EMS）的給藥周期。方法：將SD大鼠隨機分為空白對照組、CP組（40 mg/kg，腹腔注射）和EMS組（100 mg/kg，灌胃），每組9只，每24 h給藥1次，連續(xù)給藥4次。分別于第2、3、4次給藥后3 h（即首次給藥后27、51、75 h）各組隨機選取3只大鼠，處死并收集肝和胃樣本，經(jīng)過制備單細胞懸液、制片、裂解、解鏈、電泳及染色后，使用Comet Assay Ⅳ彗星試驗數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進行分析，以彗星尾部DNA百分比（Tail DNA%）、尾長（TL）和尾矩（TM）為評價指標，篩選最佳給藥周期。結(jié)果：空白對照組大鼠3個檢測時間點肝和胃的Tail DNA%、TL、TM差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明彗星試驗體系比較穩(wěn)定。與空白對照組比較，CP組和EMS組大鼠3個檢測時間點肝和胃的Tail DNA%、TL（27 h的胃除外）、TM均明顯升高（P<0.05）。其中，CP組大鼠3個檢測時間點間肝的Tail DNA%、TL、TM差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），胃的Tail DNA%、TL均在給藥51 h時最大，TM隨給藥時間的延長而升高；EMS組大鼠肝的Tail DNA%、胃和肝的TM均隨給藥時間的延長而升高。EMS組大鼠胃的Tail DNA%、肝和胃的TL均在給藥51 h時最大。結(jié)論：在進行體內(nèi)堿性彗星試驗時，建議CP和EMS的給藥周期是每24 h給藥1次，連續(xù)給藥3次。

關(guān)鍵詞 體內(nèi)堿性彗星試驗；環(huán)磷酰胺；甲基磺酸乙酯；給藥周期；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To screen the dosing period of positive drug cyclophosphamide （CP） and ethyl methanesulfonate （EMS） in alkaline comet assay of rats in vivo. METHODS： SD rats were randomly divided into blank control group， CP group （40 mg/kg， i.p.） and EMS group （100 mg/kg， i.g.）， 9 rats in each group， every 24 h， for consecutive 4 times. 3 h after secondary， third and forth medication （27， 51， 75 h after first medication）， 3 rats were randomly selected and sacrificed in each group. Liver and stomach samples were collected. After single cell suspension preparation， production， lysis， chain breaking， electrophoresis and dyeing， the evaluation indicators， including tail DNA%， tail length （TL） and tail moment （TM）， Comet Assay Ⅳ comet assay data analysis system was used to screen the optimal dosing period. RESULTS： There was no statistical significance in Tail DNA%， TL and TM of liver and stomach in blank control group at 3 test time points （P>0.05）， indicating that the comet assay system was stable. Tail DNA%， TL （except for stomach at 27 h） and TM of liver and stomach in CP and EMS groups were increased significantly， compared with blank control group （P<0.05）. There was no statistical significance in Tail DNA%， TL and TM of liver in CP group at the three test time points （P>0.05）， tail DNA% and TL of stomach in CP group were maximal at 51 h. TM was increased with dosing period. Tail DNA% of liver in EMS group， TM of stomach and liver were increased with dosing period. Tail DNA% of the stomach， TL of liver and stomach were the highest at 51 h in EMS group. CONCLUSIONS： During in vivo alkaline comet assay， it is recommended that CP and EMS be administered once every 24 h and three times continuously.

KEYWORDS Alkaline comet assay in vivo； Cyclophosphamide； Ethyl methanesulfonate； Dosing period； Rats

彗星試驗（Comet assay），又稱單細胞凝膠電泳試驗（Single cell gel electrophoresis assay），是一種快速、簡單、可視化、靈敏的試驗技術(shù)，可以直接測量和分析體內(nèi)外細胞的核DNA損傷[1-2]。彗星試驗被廣泛應(yīng)用于遺傳毒性試驗、人體生物監(jiān)測和生態(tài)遺傳毒理學等研究中[3]。彗星試驗又分為中性彗星試驗（Neutral comet assay）和堿性彗星試驗（Alkaline comet assay），中性彗星試驗常用于檢測雙鏈斷裂的DNA損傷，堿性彗星試驗則更敏感，用于檢測包括單鏈和雙鏈斷裂的少量的DNA損傷。環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CP）與甲基磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate，EMS）是遺傳毒性常見的陽性藥物，其中CP是一種廣譜抗腫瘤藥，常用于治療白血病[4]、血管炎[5]等；EMS是一種重要的突變誘導劑，可誘導動物[6]、植物[7-8]以及微生物[9]發(fā)生突變，且常存在于需要使用含有甲磺?；鶊F的化學合成過程中，已報道其具有基因毒性[10]。但是CP和EMS在藥理與毒理試驗中作為陽性藥物的給藥周期并沒有相關(guān)標準及文獻供研究者進行參考。故本研究以CP和EMS為陽性藥物，運用堿性彗星試驗進行大鼠體內(nèi)實驗，基于大鼠的肝細胞和胃細胞，篩選體內(nèi)堿性彗星試驗的給藥周期。

1 材料

1.1 儀器

CometAssay?ES彗星試驗電泳系統(tǒng)（美國Trevigen公司）；Comet Assay Ⅳ彗星試驗數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（英國Instem公司）；Nikon ECLIPSE E600熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 藥品與試劑

CP、EMS對照品（美國Sigma-Aldrich公司，批號：101767552、BCBS6100V，純度：≥95%）；CometAssay?彗星試驗試劑盒（美國Trevigen公司，批號：39280D17）；SYBR?Green熒光染液（美國Invitrogen公司，批號：20170418）；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠27只，♂，7～9周齡，體質(zhì)量為（200±20） g，購自浙江省醫(yī)學科學院，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK- （浙）2014-001，動物質(zhì)量合格證編號為1710100007。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 500 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA） 取80 mL dH2O，約2 g氫氧化鈉（NaOH），14.6 g EDTA，調(diào)pH至8.0后，加入dH2O定容至100 mL。

2.1.1 組織細胞切碎液 取500 mmol/L EDTA 2 mL至48 mL無鈣、鎂，無酚紅的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，使用前加入5.6 mL二甲亞砜（DMSO）溶液，4 ℃預冷。

2.1.3 堿性解鏈溶液（pH>13） 取NaOH 0.4 g、200 mmol/L EDTA 250 μL，加dH2O定容至50 mL。

2.1.4 堿性電泳緩沖液 NaOH 8 g，500 mmol/L EDTA 2 mL，NaOH溶解后加dH2O定容至1 L，存放于4 ℃。

2.1.5 1 mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（Tris-HCl溶液） 取Tris 12.12 g，dH2O 80 mL，濃HCl 5～6 mL，調(diào)pH至7.5后，加入dH2O定容至100 mL。

2.1.6 Tris-EDTA緩沖溶液（TE緩沖溶液） 取1 mL 1 mol/L Tris-HCl，200 μL 500 mmol/L EDTA，加入dH2O定容至100 mL。

2.1.7 CP溶液和EMS溶液 均用生理鹽水作為溶劑將CP和EMS配制成所需濃度的溶液。

2.2 分組與給藥

將大鼠隨機分成3組，分別為空白對照組、CP組和EMS組，每組9只。CP組大鼠腹腔注射CP溶液，給藥劑量為40 mg/kg；EMS組大鼠灌胃EMS溶液，給藥劑量為100 mg/kg；空白對照組大鼠灌胃生理鹽水，給藥體積為10 mL/kg。3組大鼠每隔24 h給藥1次，連續(xù)給藥4次，其中CP和EMS的劑量為藥物遺傳毒理學研究中陽性藥物的常用劑量[11]，分別于第2、3、4次給藥后3 h，即首次給藥后27、51、75 h，每組隨機抽取3只大鼠，灌胃1%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，放血處死，解剖并收集肝、胃樣本。

2.3 單細胞懸液的制備

2.3.1 肝單細胞懸液 用10 mL注射器從大鼠肝門靜脈緩慢推注預冷的生理鹽水直至肝臟鼓起發(fā)白，剪下左側(cè)肝葉一小塊組織（1 mm×2 mm），每只大鼠剪切組織塊大小應(yīng)盡量保持一致。將剪下的組織塊放入預冷的切碎液中反復清洗除去殘留血液。將洗干凈的肝組織塊放入5 mL離心管內(nèi)，加入3 mL切碎液，用眼科剪適當剪碎組織塊以釋放細胞，靜置5 min。用1 mL移液器輕輕吹打數(shù)十次后過篩（孔徑40 μm），保留上清液。用預冷的切碎液調(diào)整上清液中的肝細胞濃度為1×108個/mL用于制片。

2.3.2 胃單細胞懸液 沿胃大彎將胃剪開，用預冷的生理鹽水清洗胃部。胃表面上皮用塑料刮板刮幾次后用冷的切碎液充分沖洗。用塑料刮板輕輕刮胃黏膜5次以上釋放細胞。隨后用3 mL 切碎液將刮下的細胞制成單細胞懸浮液，用1 mL槍輕輕吹打數(shù)十次后過篩（孔徑40 μm），保留上清液。用預冷的切碎液調(diào)整上清液中的胃細胞濃度為1×108個/mL用于制片。

2.4 制片

在沸水燒杯中溶化瓊脂糖 5 min。溶化后，將瓊脂糖放入37 ℃水浴中至少20 min使其冷卻。以1 ∶ 10 （V/V）的比例將單細胞懸浮液與溶化的瓊脂糖混合在1.5 mL離心管中，吹打均勻后立即吸取50 μL至載玻片的樣品區(qū)域中，確保樣品區(qū)域的完整覆蓋。將載玻片平放在4 ℃的黑暗中（冰箱）10 min。當載玻片樣品區(qū)域的邊緣出現(xiàn)一個0.5 mm的清晰的環(huán)時，表示制片完成，可進行下一步操作。

2.5 裂解、解鏈及電泳

將載玻片置于4 ℃的裂解液[裂解液使用前加入 10 ∶ 1（V/V）的DMSO]中浸泡30～60 min。裂解結(jié)束后將載玻片浸入新鮮制備的堿性解鏈液中，pH>13，在室溫下浸泡20 min。在此期間，將電泳儀在冰箱內(nèi)降溫20 min。解鏈完成后，在電泳儀內(nèi)加入約850 mL的4 ℃堿性電泳緩沖液，將載玻片放入電泳載玻臺上（載玻片標簽與黑色陰極相鄰），并用載玻臺覆蓋層覆蓋。在冷卻槽內(nèi)放入冰袋。CometAssay?ES彗星試驗電泳系統(tǒng)電源設(shè)置為21 V/cm，電泳時間為30 min。

2.6 染色及觀察

電泳結(jié)束后，將載玻片在4 ℃的dH2O中輕輕浸泡2次，每次5 min，然后在70%乙醇中浸泡脫水5 min。然后將載玻片在37 ℃下干燥10～15 min。SYBR?Green熒光染液用TE緩沖溶液稀釋20倍，用移液槍取100 μL稀釋后的熒光染液均勻鋪到每個干燥的瓊脂糖上，并在室溫下避光染色30 min。染色結(jié)束后，輕輕敲打載玻片除去多余的熒光染液，并在水中簡單浸泡。在37 ℃下完全干燥后，置于波長為450～490 nm的熒光顯微鏡下觀察。

2.7 堿性彗星試驗結(jié)果的收集

本試驗使用Comet Assay Ⅳ彗星試驗數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對觀察到的細胞進行分析評分，并采用彗星尾部DNA百分比（Tail DNA%）、尾長（彗星頭部末端到彗星尾末端的距離，TL）和尾矩（尾長與尾部DNA百分比的乘積，TM）作為評價指標。每只大鼠的肝、胃分別隨機分析150個細胞。

2.8 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3組大鼠不同給藥時間的彗星試驗典型圖見圖1。

3.1 肝和胃的Tail DNA%

空白對照組大鼠3個檢測時間點Tail DNA%差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明試驗體系比較穩(wěn)定。與空白對照組比較，CP組和EMS組大鼠3個檢測時間點肝和胃的Tail DNA%均明顯升高（P<0.05）。其中CP組大鼠3個檢測時間點間肝的Tail DNA%差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），胃的Tail DNA%在51 h時最大；EMS組大鼠肝的Tail DNA%隨給藥時間的延長而升高，胃的Tail DNA%也在51 h時最大。說明CP和EMS首次給藥后51 h的Tail DNA%最敏感。3組大鼠肝和胃中的Tail DNA%的測定結(jié)果見表1。

3.2 肝和胃的TL

空白對照組大鼠3個檢測時間點TL差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明試驗體系比較穩(wěn)定。與空白對照組比較，CP組和EMS組大鼠除了首次給藥后27 h胃的TL差異無統(tǒng)計學意義外（P>0.05），其余檢測時間點肝和胃的TL均明顯升高（P<0.05）。其中，CP組大鼠3個檢測時間點間肝的TL差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），胃的TL在51 h時最大；EMS組大鼠肝和胃的TL均在51 h時最大。說明CP和EMS首次給藥后51 h的TL最敏感。3組大鼠肝和胃中的TL的測定結(jié)果見表2。

3.3 肝和胃的TM

空白對照組大鼠3個檢測時間點TL差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明試驗體系比較穩(wěn)定。與空白對照組比較，CP和EMS組大鼠3個檢測時間點肝和胃的TM均明顯升高（P<0.05）。其中，CP組大鼠3個檢測時間點間肝的TM差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），胃的TM隨給藥時間的延長而升高；EMS組大鼠肝和胃的TM均隨給藥時間的延長而升高。3組大鼠肝和胃中的TM的測定結(jié)果見表3。

4 討論

遺傳毒性研究是藥物非臨床安全性評價的重要內(nèi)容，在我國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）于2007年頒布的《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導原則》中，推薦的標準組合為一項體外細菌基因突變試驗、一項采用哺乳動物細胞進行的體外染色體損傷評估試驗，或體外小鼠淋巴瘤TK基因突變試驗、一項采用嚙齒類動物造血細胞進行的體內(nèi)染色體損傷試驗。近年來隨著對遺傳毒性認識的不斷提高，遺傳毒性新技術(shù)和新方法得到完善與發(fā)展，并積累了大量的數(shù)據(jù)，如體外微核試驗、體內(nèi)彗星試驗、轉(zhuǎn)基因模型。同時，體外哺乳動物細胞試驗假陽性率過高的情況引起了廣泛的關(guān)注[12-14]。鑒于上述原因，國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會議（ICH）遺傳毒性指導委員會于2006年6月啟動遺傳毒性指導原則的修訂工作，并于2011年11月正式修訂完成，并推薦給歐盟、美國和日本采納和使用。為了保證藥物遺傳毒性研究的準確性和可靠性，我國CFDA參照ICH、美國食品和藥物管理局（FDA）、經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）相關(guān)遺傳毒性指導原則于2018年3月頒布了新的藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導原則。新指導原則推薦的標準組合增加了可選性，體內(nèi)彗星試驗是其推薦的一項體內(nèi)實驗，該方法是一項可以直接檢測核DNA損傷的敏感實驗方法，可以檢測DNA單/雙鏈損傷、堿性不穩(wěn)定位點、DNA交聯(lián)等多種損傷類型，因此該實驗方法是研究突變修飾和遺傳性改變的有效手段。

前期已有研究人員利用EMS和CP建立體內(nèi)彗星試驗的方法[11，15-16]，其主要是對EMS和CP誘導的DNA損傷的劑量進行探討。CP是常用的遺傳毒性評價的陽性藥物，在體內(nèi)實驗給藥途徑一般為腹腔注射，但大部分藥物的給藥方式為口服給藥，為保證給藥方式的一致性，本研究還選取了口服藥物EMS作為遺傳毒理學評價的陽性藥物。本研究參考前期研究的EMS和CP劑量，就二者給藥周期對彗星試驗結(jié)果的影響進行研究。根據(jù)《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導原則》要求，彗星試驗結(jié)果的評價指標為彗星Tail DNA%、TL和TM，其中以Tail DNA%為主。本研究也對彗星試驗的Tail DNA%、TL和TM進行了分析，在3個時間點的檢測中，空白對照組大鼠的Tail DNA%、TL和TM均處于一個比較穩(wěn)定的數(shù)值，說明彗星試驗系統(tǒng)比較穩(wěn)定。EMS和CP誘導的DNA損傷均能通過彗星Tail DNA%、TL和TM進行反映，其中以Tail DNA%和TM最敏感，在3個檢測時間點中均明顯高于空白對照組，而TL在首次給藥后27 h胃的檢測中與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義。OECD建議將Tail DNA%作為彗星試驗最主要參數(shù)，其他參數(shù)可作為參考，因此在今后的彗星試驗的分析過程中建議以彗星Tail DNA%作為主要的評價指標，TL和TM作為補充指標。

在本研究中，筆者選取了胃和肝作為彗星試驗檢測的靶器官，其中肝是藥物在體內(nèi)代謝的主要靶器官，而在進行藥物安全性評價過程中，口服給藥是最常見的給藥方式，因此選取胃（與藥物接觸的主要器官）作為口服給藥的檢測靶器官。研究結(jié)果顯示，胃和肝均是比較敏感的靶器官，且在EMS和CP首次給藥后51 h和75 h胃的Tail DNA%、TL和TM比肝更敏感。在給藥后的檢測點中，筆者選取了首次給藥后27、51、75 h進行分析，結(jié)果顯示，在首次給藥后以51 h的結(jié)果靈敏度和彗星圖片的清晰度最佳。日本替代方法驗證中心（JaCVAM）聯(lián)合驗證結(jié)果表明，連續(xù)3 d給藥能更靈敏地檢測化合物遺傳毒性作用，故一般選擇給藥周期為3 d[17]，OECD還推薦將體內(nèi)彗星試驗整合到亞慢性毒性實驗中，以減少動物的使用。本研究結(jié)果同樣表明連續(xù)給藥3次后檢測效果最佳。

綜上所述，在對藥物進行體內(nèi)堿性彗星試驗時，建議陽性藥CP和EMS的給藥周期是每24 h給藥1次，連續(xù)給藥3次。

參考文獻

[ 1 ] TICE RR，AGURELL E，ANDERSON D，et al. Single cell gel/comet assay：guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing[J]. Environ Mol Mutagen，2000，35（3）：206-221.

[ 2 ] MARCINIAK B，LOPACZYNSKA D，F(xiàn)ERENC T. Evaluation of the genotoxicity of alpha-amanitin in mice bone marrow cells[J]. Toxicon，2017.DOI：10.1016/j.toxicon.2017. 07.005.

[ 3 ] COLLINS AR. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay[J]. Biochim Biophys Acta，2014，1840（2）：794-800.

[ 4 ] MAURO FR，CARELLA AM，MOLICA S，et al. Fludarabine，cyclophosphamide and lenalidomide in patients with relapsed/refractory chronic lymphocytic leukemia. A multicenter phase Ⅰ-Ⅱ GIMEMA trial[J]. Leuk Lymphoma，2017，58（7）：1640-1647.

[ 5 ] FAUCI AS，KATZ P，HAYNES BF，et al. Cyclophosphamide therapy of severe systemic necrotizing vasculitis[J].N Engl J Med，1979，301（5）：235-238.

[ 6 ] CATTANACH BM，POLLARD CE，ISAACSON JH. Ethyl methanesulfonate-induced chromosome breakage in the mouse[J]. Mutat Res，1968，6（2）：297-307.

[ 7 ] SHIRASAWA K，HIRAKAWA H，NUNOME T，et al. Genome-wide survey of artificial mutations induced by ethyl methanesulfonate and gamma rays in tomato[J]. Plant Biotechnol J，2016，14（1）：51-60.

[ 8 ] MISHRA A，SINGH A，SHARMA M，et al. Development of EMS-induced mutation population for amylose and resistant starch variation in bread wheat （Triticum aestivum） and identification of candidate genes responsible for amylose variation[J]. BMC Plant Biol，2016，16（1）：217.

[ 9 ] PAWAR N，PANCHAL S，KAWLE D，et al. Evaluation of genotoxic and modulatory effects of Nyctanthes arbor- tristis calyx extract and the isolated crocin in Ames assay[J]. Nat Prod Res，2017.DOI：10.1080/14786419.2017.

[10] Giordani A，Kobel W，Gally HU. Overall impact of the regulatory requirements for genotoxic impurities on the drug development process[J]. Eur J Pharm Sci，2011，43（1）：1-15.

[11] 王欣，王雪，宋捷，等.大鼠體內(nèi)彗星試驗方法的建立與應(yīng)用研究[J].藥物評價研究，2012，35（1）：6-9.

[12] KIRKLAND D，ARDEMA M，MULLER L，et al. Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens Ⅱ. Further analysis of mammalian cell results，relative predictivity and tumour profiles[J]. Mutat Res，2006，608（1）：29-42.

[13] 周長慧，王征，涂宏剛，等. OECD遺傳毒性最新修訂指導原則的解析[J].中國新藥雜志，2015，24（18）：2052- 2059.

[14] 張銘，黃芳華，周長慧，等. ICH遺傳毒性指導原則S2（R1）修訂要點及相關(guān)背景介紹[J].中國新藥雜志，2013，22（2）：146-149.

[15] 韓天嬌，周長慧，常艷.體內(nèi)堿性彗星試驗與微核試驗聯(lián)合測定甲磺酸乙酯遺傳毒性方法的建立[J].癌變 畸變 突變，2016，28（4）：277-280.

[16] 王欣，王晨，宋捷，等.體內(nèi)彗星實驗聯(lián)合微核實驗檢測化合物的遺傳毒性[J]. 中國藥房，2014，25（33）：3107- 3109.

[17] BURLINSON B，TICE RR，SPEIT G，et al. Fourth international workgroup on genotoxicity testing：results of the in vivo comet assay workgroup[J]. Mutat Res，2007，627（1）：31-35.

（收稿日期：2018-06-03 修回日期：2018-09-27）

（編輯：鄒麗娟）