毛從劍，張煥容，張興民

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041)

羊口瘡是由羊口瘡病毒引起的以患羊口唇、口角、鼻、乳房等部位皮膚和黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂為特征的傳染病。各年齡段的羊均能感染發(fā)病，山羊比綿羊易感，其中羔羊最易感，并常為群發(fā)性流行。該病一年四季均可發(fā)生，無明顯的季節(jié)性，但多發(fā)于初春或春末夏初。截止到2014年，我國有24個省份報道過羊口瘡病例的發(fā)生，且從2000年起，該病的報道逐年遞增[1]，說明在我國養(yǎng)羊業(yè)中該病的發(fā)生及對該病的關(guān)注越來越多。該病發(fā)病嚴(yán)重時會導(dǎo)致患病羊進(jìn)食困難、營養(yǎng)攝入不足而生長緩慢甚至死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2017 年 4 月，成都某山羊養(yǎng)殖場出現(xiàn)羔羊口瘡疫情，主訴：該群母羊未免疫口瘡疫苗，羔羊出生后也未免疫口瘡疫苗。該口瘡病例診治情況報告如下。

1 發(fā)病情況

2017年4月，成都某山羊養(yǎng)殖場2周齡左右的哺乳羔羊先后出現(xiàn)不同程度的唇部、嘴角部及舌面紅腫、生瘡、疣狀增生、部分病羊患部后期結(jié)痂后緩慢恢復(fù)健康，該病采用抗生素于患病部位局部注射或涂擦治療無明顯效果，羊只發(fā)病率較高，但較少死亡。

2 臨床及剖檢病變

臨床可見病羊的唇部、嘴角部及口腔內(nèi)側(cè)壁及舌部生瘡、進(jìn)一步發(fā)展口唇部疣狀增生(見中插彩版圖1)，發(fā)病后期口瘡結(jié)痂(見中插彩版圖2)，頸前淋巴結(jié)化膿、腫大，其他臟器無明顯病變。

3 實驗室診斷

3.1 病料采集及處理 無菌采取羔羊口唇及口腔病變組織。取病變組織用無菌PBS漂洗3次后剪碎研磨，按1∶3 (W/V)加入無菌PBS制成混懸液，置-80 ℃凍融3次后加入終濃度為2 000 U/mL的雙抗，4 ℃過夜，以8 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液分裝至離心管，置-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3.2 病毒分離培養(yǎng)情況 MDBK細(xì)胞鋪滿至瓶底的80%左右時，將培養(yǎng)液棄去，用Hank′s洗滌1～3次，加入1.5 mL處理保存的病毒液，在37 ℃，5%CO2條件下感作1 h左右，棄去瓶內(nèi)液體，加入含1%雙抗和1%犢牛血清的DMEM細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，并逐日觀察細(xì)胞，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。連續(xù)盲傳至第5代時，出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、聚積、脫落；連續(xù)傳代至第10代，細(xì)胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)在接毒后96 h。

3.3 核酸提取及PCR檢測結(jié)果 用酚-氯仿法提取病變組織及細(xì)胞培養(yǎng)總DNA作為模板，PCR擴(kuò)增檢測羊口瘡病毒B2L基因片段。采用文獻(xiàn)[2]的引物序列如下：上游5′-CAC GGC CAC GAA CTT CCA CCT CAA-3′，下游5′-TCC CGC TCG AAG ACC GCA GAC AG-3′；預(yù)期目的片段大小為540 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：PremixTaq12.5 μL，模板DNA 2. 0 μL，上下游引物各1. 0 μL，加ddH2O補(bǔ)足至總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min ；94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast序列比對后，確定擴(kuò)增片段為羊口瘡病毒的B2L基因片段，表明從發(fā)病羊口唇部病變組織和細(xì)胞培養(yǎng)物中均能擴(kuò)增出特異性的羊口瘡病毒B2L基因片段。

4 診斷結(jié)果

根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢病變和羊口瘡病毒B2L基因片段擴(kuò)增結(jié)果，確診該養(yǎng)殖場發(fā)生羊口瘡病例。

圖3 MDBK正常對照細(xì)胞 (10×)

圖4 MDBK產(chǎn)生細(xì)胞病變細(xì)胞 (10×)

圖5 PCR電泳圖

5 感染血清制備及應(yīng)用

5.1 感染血清制備 對發(fā)生口瘡2周齡以上的病羊無菌采取頸靜脈血，將血液放入離心管中，待血液凝固后5 000 r/min離心10 min，吸出血清裝至離心管中，加入終濃度為0.01%硫柳汞，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2 感染血清的應(yīng)用 將制備好的感染血清用于剛發(fā)病的羔羊，每只羔羊口唇部肌肉注射1 mL，間隔兩天再注射1次，同時配合抗生素治療，結(jié)果初發(fā)口瘡的病羔羊病情得到有效控制，一般在康復(fù)血清治療后1周左右完全恢復(fù)健康。

6 討論

根據(jù)病羊的典型臨床癥狀，初步診斷為羊口瘡病例，為了確診，從具有典型羊口瘡臨床癥狀的發(fā)病黑山羊口唇部及口腔病變組織采集病料，用MDBK細(xì)胞作為病毒增殖細(xì)胞，盲傳至第5代時出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變，病變細(xì)胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉網(wǎng)、脫落現(xiàn)象，與殷震[3]等描述的羊口瘡病毒致細(xì)胞病變特征基本一致，并在羊口唇部及口腔病變組織、細(xì)胞培養(yǎng)液中檢測到了羊口瘡病毒特異性B2L基因片段，確診該起病例為羊口瘡病毒感染所導(dǎo)致。

近年來我國山羊口瘡發(fā)病率不斷上升，且羔羊

發(fā)生羊口瘡的日齡越來越小，1周齡內(nèi)羔羊發(fā)生口瘡的現(xiàn)象越來越多，在此情況下，疫苗接種新生羔羊來不及起到有效保護(hù)作用，因此，只有通過母源抗體讓羔羊出生后就能獲得被動免疫保護(hù)。有研究表明，在孕羊產(chǎn)前接種羊口瘡滅活疫苗2～3次，對新生羔羊有很好的保護(hù)效果[4-5]。本次山羊羔口瘡疫情連續(xù)發(fā)生，持續(xù)1月以上，是由于該群母羊沒有接種口瘡疫苗，羔羊出生后也未免疫口瘡疫苗，通過采用先期發(fā)病后至少兩周的病羊血清治療后期初發(fā)病的羔羊，對初發(fā)口瘡病羔羊的病情得到了有效的控制，證明特異性的感染血清可用于初發(fā)口瘡病羔羊的緊急救治[6]，特異性的抗病血清對初發(fā)口瘡的病羔的治療作用與母源抗體對后代羔羊的早期被動免疫保護(hù)作用是一致的。目前，對羊口瘡病還沒有特效治療藥物，因此對羊群的免疫接種是預(yù)防該病的關(guān)鍵，本病例中畜主未對母羊進(jìn)行免疫，也未對初生羔羊進(jìn)行口瘡疫苗的接種，是導(dǎo)致該養(yǎng)殖場暴發(fā)羊口瘡病例的根本原因。此外羊口瘡病毒主要是由結(jié)痂病料引起的環(huán)境污染經(jīng)受損的皮膚、黏膜感染機(jī)體，因此在日常管理中要注意保護(hù)羊只的皮膚、黏膜免受損傷；對羊舍、用具及周圍環(huán)境及時消毒，以減少羊口瘡病的發(fā)生。