曹素芳

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)學院，河南鄭州450046)

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的傳染病，主要特點是母豬繁殖障礙，仔豬嚴重呼吸道疾病，公豬精液質(zhì)量下降。該病最早發(fā)生于北美洲和歐洲[1，2]。自從1996年我國出現(xiàn)該病后長期存在。近年來，PRRSV不斷發(fā)生變異，出現(xiàn)了高致病性毒株，其感染率、死亡率大大提高。盡管已有疫苗預防該病，但高致病性PRRSV毒力強，易變異，現(xiàn)有疫苗提供的保護有限，且目前仍無特效藥，導致該病仍在我國呈廣泛性區(qū)域流行。因此，尋找新的抗病毒策略，對控制高致病性PRRSV感染十分必要。

PRRSV包含12個開放性閱讀框。其中ORF7基因編碼PRRSV的核蛋白，該蛋白是最早產(chǎn)生的，且具有很好的抗原性，常被用作早期診斷抗原[3]。核蛋白間通過二硫鍵形成同源二聚體，參與病毒粒子的裝配[4]。

目前，RNA干擾技術(shù)已經(jīng)廣泛用于病毒性疾病的控制，許多研究表明，靶向病毒特異性基因的小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)具有明顯的抗病毒效果，能顯著抑制病毒的復制。近年來，國內(nèi)外許多研究者應用RNA干擾技術(shù)對PRRSV ORF7基因進行了研究，Bao[5]、李治軍[6]等利用人工合成法、桿狀病毒介導法及腺病毒介導法對ORF7基因的RNA干擾分子抑制PRRSV進行了研究。本研究評價了靶向HP-PRRSV ORF7基因的siRNA重組質(zhì)粒體外特異性抑制HP- PRRSV的復制,通過IFA試驗，測定病毒滴度及有效感染持續(xù)時間的檢測，觀察到siRNA特異性抗病毒活性，以期為防控高致病性豬繁殖與呼吸綜合征提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒提取試劑盒，購自QIAGEN公司；抗PRRSV N蛋白特異性單抗、β-actin單克隆抗體，購自TaKaRa公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，購自Invitrogen公司；G418，購自Roeh公司；siRNA重組質(zhì)粒pSilencer-N2、pSilencer-Negti ve和HP-PRRSV HN1株分別由本人構(gòu)建保存。FITC標記羊抗鼠I，購自Santa Crus公司；Marc-145細胞由王旭光博士惠贈。DMEM培養(yǎng)，購自Gbico公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA重組質(zhì)粒pSilencer-N2的大量制備與純化 將凍存的含有重組質(zhì)粒pSilencer-N2、陰性對照質(zhì)粒pSilencer-Negtive(5′-AGCTT CTGACGACGGATCAGCGCTACTCTCTT GAAGTAGCGCTGATCCGTCGTGCG-3′)的細菌劃線培養(yǎng)，挑取單個菌落接種于Amp+ LB中培養(yǎng)過夜，按質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞中接種HP-PRRSV HN1株劑量及時間的確定

1.2.2.1 HP-PRRSV HN1最佳接種劑量 將Marc-145細胞培養(yǎng)至豐度約為80%，分別接種0.1MOI、0.01MOI和0.001MOI HP-PRRSV HN1株，48 h后用 500 μL 80%冷丙酮于-20 ℃固定細胞過夜，干燥，用PBS洗滌3次，每孔加入200倍稀釋的抗PRRSV N蛋白熒光抗體200 μL，37 ℃溫育1 h；棄抗體，用 PBS洗滌4次，于熒光顯微鏡下進行觀察。在 200×視野下，每孔隨機挑選10個視野進行照相，計算被熒光染色的細胞數(shù)目，以確定病毒最佳接種劑量。

1.2.2.2 HP-PRRSV HN1最佳接種時間 將Marc-145培養(yǎng)至豐度80%，按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書分別轉(zhuǎn)染pSilencer-N2和pSilencer-Negtive，轉(zhuǎn)染后 6 h、12 h、18 h 和24 h分別以最佳接種劑量接種HP-PRRSV HN1,接毒后48 h收集細胞上清，按1.2.4方法進行TCID50測定，比較不同接毒時間pSilencer-N2對病毒的抑制效率，最終確定最佳接毒時間。

1.2.3 間接免疫熒光法(IFA)檢測 siRNA 在轉(zhuǎn)染細胞中對HP-PRRSV HN1的抑制 將Marc-145細胞培養(yǎng)至豐度約80%時，用無血清的DMEM洗滌3遍，分別將純化后的3 μg重組質(zhì)粒pSilencer-N2、pSilencer- Negti ve按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒的使用說明書轉(zhuǎn)染Marc-145細胞，轉(zhuǎn)染24 h后接種0.01細胞MOI HP- PRRSV HN1，同時做病毒對照和細胞空白對照。接毒48 h后收集所有細胞上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。將細胞用胰酶消化，離心收集細胞，用PBS洗滌3次，取適量細胞滴在載玻片上，冷丙酮固定15min，PBS洗滌3遍，加N蛋白特異性單抗，37 ℃孵育l h，棄單抗，用PBST洗滌5次，棄盡洗液后，每片加1∶200稀釋的FICT羊抗鼠IgG，37 ℃孵育l h，PBST洗滌4次，封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 測定HP-PRRSV的TCID50各取100 μL上述收集的細胞上清進行10倍稀釋(10-1～10-8)，每個稀釋度做3個重復，將各稀釋度的病毒液接種于96孔板中已長成單層的Marc-145 細胞,每孔接種100 μL病毒液，培養(yǎng)48 h后,觀察細胞病變，按Reed與Muench法[7]計算病毒的TCID50。

1.2.5 Western Blot檢測 HP-PRRSV N 蛋白的表達 收獲上述接種病毒48 h后的Marc-145細胞裂解，離心取上清，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜上，NC膜用10%脫脂乳封閉過夜，加抗核蛋白單克隆抗體或抗β-actin單克隆抗體室溫作用2 h，PBST洗滌3次，加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體作用1 h,用PBST洗滌3次，用化學發(fā)光顯色試劑盒顯色。同時以β-actin為內(nèi)參，檢測其表達水平。

1.2.6 siRNA重組表達質(zhì)粒抑制HP-PRRSV復制持續(xù)時間 將重組質(zhì)粒pSilencer-N2和pSilencer- Negtive分別轉(zhuǎn)染Marc-145細胞中，檢測病毒感染后24 h、48 h、72 h、96 h和120 h的細胞病變，同時測定病毒滴度。

1.2.7 統(tǒng)計分析 所有的數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著(P< 0.05)。

2 結(jié)果

2.1 HP-PRRSV最佳接種劑量 分別以0.1 MOI、0.01 MOI和0.001 MOI接種轉(zhuǎn)染siRNA的Marc-145細胞，48 h后進行直接免疫熒光檢測，結(jié)果表明，當接毒量為0.1 MOI和0.001 MOI 時，熒光顯微鏡視野中出現(xiàn)了少量的熒光細胞，而接毒劑量為0.01 MOI時，視野中幾乎均是熒光細胞，細胞感染HP- PRRSV近100%(見中插彩版圖1)，故此確定HP-PRRSV 最佳接種劑量為0.01 MOI。

2.2 HP-PRRSV最佳接毒時間 將pSilencer-N2和pSilencer-Negtive分別轉(zhuǎn)染Mac-145細胞，6 h、12 h、18 h、24 h后分別接種0.01 MOI HP-PRRSV HN1株，接毒后48 h收集細胞上清，測定其TCID50，統(tǒng)計分析結(jié)果(圖2)，與轉(zhuǎn)染pSilencer-Negtive細胞上清中病毒的TCID50相比,當轉(zhuǎn)染24 h后接種HP- PRRSV 時，pSilencer-N2對HP-PRRSV HN1株的抑制效率最高，轉(zhuǎn)染pSilencer-N2的細胞上清中病毒 TCID50顯著下降(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染后6 h、12 h和18 h接種HP-PRRSV HN1株時pSilencer-N2干擾病毒效果不明顯，與pSilencer-Negtiveg組TCID50相比差異不顯著。從而確定轉(zhuǎn)染后24 h為最佳接種時間。

圖2不同時間接種0.01MOIHP-PRRSV干擾效果比較

2.3 IFA法檢測pSilencer-N2對HP-PRRSV的抑制作用 熒光顯微鏡觀察，紅色為N蛋白陰性細胞，綠色為N蛋白陽性細胞。IFA結(jié)果顯示，pSilencer-N2轉(zhuǎn)染細胞中的N蛋白陽性細胞明顯比pSilencer-Negative轉(zhuǎn)染細胞中的少，而pSilencer-Negative轉(zhuǎn)染細胞中的N蛋白陽性細胞數(shù)和未轉(zhuǎn)染的接毒對照細胞相比，變化不明顯(見中插彩版圖3)。

2.4 病毒滴度的測定 將pSilencer-N2和pSilencer-Negtive分別轉(zhuǎn)染96孔板中Marc-145細胞，轉(zhuǎn)染后24 h接種HP-PRRSV HN1株，48 h后測定各孔病毒滴度TCID50，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與病毒對照(105.6TCID50/mL)和pSilencer-Negtive(105.4TCID50/mL)轉(zhuǎn)染孔相比，pSilencer-N2轉(zhuǎn)染孔的病毒滴度(103.0TCID50/mL)降低了2.6個數(shù)量級(圖4)，表明pSilencer-N2能夠顯著抑制HP-PRRSV在Marc-145細胞中的復制。

2.5 Western Blot檢測 用抗HP-PRRSV N 蛋白的單克隆抗體進行Western Blot檢測N蛋白表達水平，結(jié)果顯示，與病毒對照和pSilencer-Negtive轉(zhuǎn)染孔相比，pSilencer-N2能顯著抑制HP-PRRSV N蛋白的表達，蛋白條帶明顯減弱(圖5)。

圖4TCID50檢測siRNA對HP-PRRSV抑制效果

圖5 Western Blot 檢測

2.6 有效干擾持續(xù)時間檢測 將siRNA重組質(zhì)粒pSilencer-N2和對照質(zhì)粒pSilencer-Negtive分別轉(zhuǎn)染Marc-145細胞，24 h、48 h、72 h、96 h和120 h后觀察細胞病變，并測定細胞上清中病毒TCID50。結(jié)果表明，與病毒對照和pSilencer-Negtive組相比，轉(zhuǎn)染pSilencer-N2的Marc-145細胞顯著抑制HP-PRRSV的增殖，在病毒感染后72 h才出現(xiàn)的細胞病變，到96 h才出現(xiàn)明顯的細胞病變，推遲CPE 的發(fā)生時間 (圖6)。與pSilencer-Negtive組相比，從24 h到 96 h pSilencer-N2實驗組TCID50顯著下降(P<0.05)，至96 h時升高達到對照組水平，表明篩選出的有效siRNA對HP-PRRSV的顯著干擾時間可持續(xù)96 h(圖7)。

圖6 siRNA對HP-PRRSV持續(xù)抑制的細胞病變觀察

圖7 siRNA持續(xù)抑制HP-PRRSV 在Marc-145細胞中的復制

3 討論

RNAi是生物自身體內(nèi)的一種防御機制，也是抗病毒治療強有力的工具。許多研究表明，人工合成的siRNA或用質(zhì)粒、病毒載體介導siRNA均可實現(xiàn)對病毒復制的干擾，因此RNAi在抗病毒感染中發(fā)揮著重要的作用。鑒于目前還沒有有效防控高致病性豬繁殖與呼吸綜合征手段，尋找新的抗病毒策略十分必要。

ORF7編碼PRRSV的核衣殼蛋白(N蛋白)，N蛋白不但是PRRSV的主要抗原，且參與病毒粒子的組裝。如果利用RNAi技術(shù)抑制N蛋白基因的表達,就會阻止PRRSV的組裝,從而抑制PRRSV的復制。前期研究表明，siRNA重組質(zhì)粒pSilencer-N2在細胞中能有效抑制N蛋白基因的表達，本試驗繼續(xù)探索其體外對HP-PRRSV復制的抑制效果，結(jié)果表明，在HP-PRRSV最適接毒劑量0.01MOI和最佳接毒時間24 h的條件下，病毒感染后48 h，通過間接熒光免疫試驗、病毒滴度測定及N蛋白表達檢測，結(jié)果顯示，表明pSilencer-N2能夠顯著抑制HP-PRRSV在Marc-145細胞中的復制，與病毒對照和陰性對照質(zhì)粒pSilencer-Negtive轉(zhuǎn)染孔相比，pSilencer-N2轉(zhuǎn)染孔的病毒滴度降低了2.6個數(shù)量級，且能明顯抑制N蛋白基因在表達。然而，本試驗觀察到pSilencer -N2在Marc-145細胞中并未完全抑制HP-PRRSV，究其原因可能有以下幾點：一可能是轉(zhuǎn)染siRNA重組質(zhì)粒的劑量及與脂質(zhì)體的比例沒有進行有效優(yōu)化。本試驗轉(zhuǎn)染siRNA重組質(zhì)粒為3 μg,與脂質(zhì)體的比例的1∶2，而黃良宗等[8]轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的量為0.7 μg，與脂質(zhì)體的比例為1∶1,黃娟[9]轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的量卻為0.4 μg，與脂質(zhì)體的比例為1∶3；二可能是與選擇靶序列的位點有關(guān)。本研究選擇的靶向HP-PRRSV N蛋白基因的N179位點，盡管對HP-PRRSV有很好的抑制效果，但不能完全抑制HP-PRRSV在細胞中的復制，楊閩楠等[10]選擇PRRSV N蛋白基因的N12、N23、N263個靶位點，研究證明N12干擾靶位可以高效抑制PRRSV的增殖,說明N蛋白基因高效siRNA靶位點的選擇對siRNA干擾病毒的復制至關(guān)重要；三可能是HP-PRRSV變異快，在培養(yǎng)細胞中可能出現(xiàn)逃逸現(xiàn)象，從而逃脫了siRNA的干擾，導致HP-PRRSV在感染細胞中大量復制。

對siRNA干擾的持續(xù)時間檢測結(jié)果表明，與病毒對照和陰性干擾質(zhì)粒Silencer-Negtive組相比，轉(zhuǎn)染siRNA重組質(zhì)粒pSilencer-N2在Marc-145細胞中明顯抑制HP-PRRSV的增殖，在病毒感染后72 h才出現(xiàn)的細胞病變，到96 h出現(xiàn)明顯的細胞病變，推遲CPE 的發(fā)生時間，而且從24 h到96 h，pSilencer-N2實驗組的TCID50顯著下降(P<0.05)，至96 h時達到對照組水平，表明靶向HP-PRRSV N蛋白基因的siRNA在細胞中抑制HP-PRRSV的復制可持續(xù)到感染后第4天，隨后子代病毒產(chǎn)生逐漸上升，到感染后第5天達到對照組的水平，與黃娟[13]研究結(jié)果不盡相同,其可能的原因是選擇的靶位點不同、接種病毒量不同以及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的量不同。