周 葉，宋開放，崔琳琳，翟煥杰，邵立圣，楊樹宇，姜金慶，劉俊偉

(河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

羊結(jié)腸小袋纖毛蟲病是由纖毛蟲綱、毛口目、小袋蟲科、小袋蟲屬的結(jié)腸小袋纖毛蟲寄生于羊的大腸內(nèi)所引起的以腹瀉、脫水、消瘦和貧血為特征的人獸共患原蟲病。引起羊腹瀉的疾病，臨床常見的有球蟲病、鞭蟲病、羔羊痢疾、大腸桿菌病、沙門菌病、食道口線蟲病、夏伯特線蟲病、食鹽中毒、隱孢子蟲病、副結(jié)核病等[1-2]，但關(guān)于羊結(jié)腸小袋纖毛蟲病引起的腹瀉尚未見報道。筆者在獸醫(yī)臨床診療過程中，通過對疑似羊結(jié)腸小袋纖毛蟲病的病羊進(jìn)行臨床檢查，糞便實驗室檢驗，糞便水洗沉淀物染色鏡檢，藥物敏感性試驗，診斷為羊結(jié)腸小袋纖毛蟲病，并用甲硝唑、中藥驅(qū)蟲凈散等進(jìn)行了防治試驗，有效控制了該病，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 試驗羊來自新鄉(xiāng)市某杜泊綿羊養(yǎng)殖戶，飼養(yǎng)規(guī)模100只，放牧散養(yǎng)，其中30只患嚴(yán)重腹瀉疾病。

1.2 試劑與藥品 可溶性淀粉培養(yǎng)基、蒸餾水、生理鹽水、二甲苯、0.4%氫氧化鈉溶液、2%碘液、美藍(lán)染色液、甲醇、2.5%戊二醛、福爾馬林、甲硝唑片等，由河南科技學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)教研室提供；中藥驅(qū)蟲凈散的原材料，購自新鄉(xiāng)市醫(yī)藥公司，并按文獻(xiàn)3的方法進(jìn)行制備。

1.3 臨床檢查 采用問診、視診等臨床基本檢查方法對發(fā)病羊群進(jìn)行檢查，調(diào)查羊場的病史和臨床發(fā)病癥狀。

1.4 糞便采集 采集糞便時，術(shù)者依次戴上醫(yī)用乳膠手套和PVC手套，直接用手指從直腸內(nèi)掏取糞便，再將PVC手套翻轉(zhuǎn)脫下，羊糞即被包含其中，也可將采集到的羊糞放入潔凈塑料袋中，編號登記后備用。如不能及時送檢，可稱取糞便10 g，加入90 mL 2.5%戊二醛或5%～10%福爾馬林中固定后送檢。

1.5 糞便直接壓片法檢查 取一片潔凈的載玻片，在玻片中央滴加1～2滴生理鹽水(冬季需加溫)，然后用鑷子挑取少量糞便，與蒸餾水混勻，并將粗糞渣推向一邊，涂布均勻，作成涂片，涂片的厚薄以放到書上隱約可見下面的字跡為宜，加上蓋玻片，置顯微鏡下檢查。糞便采集后應(yīng)注意保溫，并及時送檢，冬季可放置28 ℃培養(yǎng)后再進(jìn)行觀察，防止羊結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體運動性喪失或胞膜破裂。

1.6 糞便水洗沉淀物染色鏡檢 取4個1.5 mL離心管，加入羊結(jié)腸糞便混懸液各1 mL，1 500 r/min離心2 min，棄去上清液，分別加入美藍(lán)染色液，2%碘液，蘇木素染色液，瑞氏染色液各1 mL，震蕩混勻，置室溫染色，定期觀察染色效果，染色完畢，1 500 r/min離心2 min，棄去染色液，用蒸餾水離心洗滌3次，終止染色，必要時用1%鹽酸乙醇或蒸餾水分化，再用60%、70%、80%、90%、100%乙醇(2%碘液組脫水后，還需經(jīng)2%碘無水乙醇復(fù)染)，逐級脫水，每級脫水15 min，之后離心棄去上清液，沉淀加入二甲苯1 mL，震蕩混勻，透明30 min，離心后，用加樣器吸取0.7 mL二甲苯，震蕩混勻，吸取懸液10 μL，均勻涂于載玻片中部，待二甲苯將干未干之際滴1滴中性膠，用眼科鑷子夾一洗凈擦干的蓋玻片，使蓋玻片一端銜接處中性膠后輕輕放下，中性膠即平鋪于蓋玻片之下，之后玻片于60 ℃干燥箱中烘干，置顯微鏡下觀察。

1.7 藥物敏感性試驗 首先用可溶性淀粉培養(yǎng)結(jié)腸纖毛蟲：復(fù)方氯化鈉注射液500 mL，無菌操作加入標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清25 mL，震蕩混勻，置用4 ℃冰箱備用，用時每8 mL加入滅菌可溶性淀粉一鉑耳，進(jìn)行前述糞便中結(jié)腸小袋纖毛蟲人工培養(yǎng)[4]。

然后，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入可溶性淀粉培養(yǎng)基50 μL/孔，至第12孔；每孔分別加入羊結(jié)腸小袋纖毛蟲懸液50 μL，輕輕震蕩細(xì)胞培養(yǎng)板，使各孔混勻，置28 ℃培養(yǎng)12 h，置倒置顯微鏡下觀察羊結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體的存活情況。將丙硫苯咪唑，鹽酸左旋咪唑，甲硝唑，痢特靈，乳酶生，土霉素片，復(fù)方新諾明，血蟲凈、氨芐青霉素鈉和中藥驅(qū)蟲凈散制備成100 mg/mL混懸液或溶液，在前述細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入倍比稀釋的藥品溶液100 μL，觀察小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體的存活情況。

1.8 藥物防治試驗 將羊場患嚴(yán)重腹瀉的30只羊，根據(jù)發(fā)病情況平均劃分為甲、乙兩組，每組15只。甲組病羊用甲硝唑10 mg/kg體重，經(jīng)口灌服，2次/d，連用3 d。乙組病羊用中藥驅(qū)蟲凈散治療，體重在50 kg以上的羊投50 g/次，體重在50 kg以下的羊25 g/次，開水沖，候溫一次灌服，1次/d，連用7 d。同時，重癥病羊配合補液，補糖，補充鈣、磷和氨基酸，配合抗菌、止瀉、解毒、強(qiáng)心、健胃等對癥治療措施。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床檢查結(jié)果 筆者走訪發(fā)現(xiàn)，該綿羊養(yǎng)殖戶采用圈養(yǎng)結(jié)合放牧的飼養(yǎng)方式，放牧?xí)r采食路邊、河邊的雜草和落葉，補飼花生秧、玉米、豆腐渣等飼料，圈舍是靠墻搭建的水泥瓦棚，糞尿清理不及時，有刺鼻氨氣味，戶主曾使用伊維菌素驅(qū)蟲。本次共30只羊發(fā)病，發(fā)病率為30%，典型癥狀與其他動物結(jié)腸小袋纖毛蟲病一致[5-7]。嚴(yán)重者多見于3～4月齡羔羊，可見病羊精神沉郁，體溫39.5 ℃～40.5 ℃，食欲減退或廢絕，飲欲增加，眼球下陷，皮膚彈性下降，起初排出軟糞，很快變?yōu)楹隣钕〖S，甚至呈水樣，帶有黏液，氣味腥臭，后軀及尾部被稀糞污染。慢性病例多見于產(chǎn)后母羊，病羊精神不振，四肢無力，喜歡臥地，食欲減退，異嗜，食欲廢絕，體溫正?；虻拖?，病羊日漸消瘦，皮下脂肪減少，綿羊尾脂急劇減少，被毛粗亂，黏膜淡白或蒼白，糞便含水量增加，排團(tuán)狀或條狀軟糞，呈粒狀、團(tuán)狀或泥狀。

2.2 糞便直接壓片法鏡檢結(jié)果 病羊新鮮糞便直接壓片鏡檢時，由于滋養(yǎng)體不斷運動，觀察和拍攝相對困難，可在蟲體運動緩慢時用快門進(jìn)行連續(xù)拍攝，結(jié)果見圖1。羊結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體呈梨形、紡錘形、卵圓形或圓形，灰黃或灰黑色，前端稍尖，中部最寬，后端稍圓。滋養(yǎng)體全身密生纖毛，纖毛擺動時呈規(guī)律的波浪狀，使滋養(yǎng)體迅速前進(jìn)，旋轉(zhuǎn)。伸縮泡無色透明，有前、后兩個，后方的一般較大，病羊糞便越稀，滋養(yǎng)體數(shù)目越多，運動越活潑，后伸縮泡也越大，甚至可達(dá)滋養(yǎng)體的二分之一[8]。

圖1 羊結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體，糞便直接壓片 (400×)

2.3 糞便水洗沉淀物染色結(jié)果 糞便沉淀物水洗后，可見為數(shù)眾多的結(jié)腸小袋纖毛蟲包囊。包囊為休眠期蟲體，呈球形或卵圓形，灰黃或淡綠色，無纖毛，不運動，有2層囊膜，外膜較內(nèi)膜稍厚，有時還可見到處于脫水濃縮期的包囊，其染色結(jié)果見中插彩版圖2～5。羊結(jié)腸小袋纖毛蟲包囊美藍(lán)染色30 min，囊膜不著色，呈紅色，在囊膜外殘留的滋養(yǎng)體期的外膜呈淡藍(lán)色，外質(zhì)淡藍(lán)色，內(nèi)質(zhì)深藍(lán)色，食物泡和伸縮泡呈淡藍(lán)色，胞核呈深藍(lán)色(中插彩版圖2)。羊結(jié)腸小袋纖毛蟲包囊2%碘液染色30 min，胞膜不著色，呈紅色，內(nèi)質(zhì)深黃色，外質(zhì)、伸縮泡和胞核呈土黃色(中插彩版圖3)。羊結(jié)腸小袋纖毛蟲包囊瑞氏染色24 h，囊膜外層淡藍(lán)色，內(nèi)層為淡紅色，外質(zhì)淡紅色，內(nèi)質(zhì)、食物泡和胞核呈紫紅色(中插彩版圖4)。羊結(jié)腸小袋纖毛蟲包囊蘇木素染色12 h，胞漿呈黃色，胞核淡紅色；染色24 h，胞漿粉紅色，食物泡和胞核呈深紫紅色(中插彩版圖5)。包囊的染色時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于滋養(yǎng)體，說明包囊膜結(jié)構(gòu)致密，通透性差，不易著染，而滋養(yǎng)體由于有胞口和胞肛的存在，通透性強(qiáng)，易于染色。

2.4 藥物敏感性試驗結(jié)果 羊結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體對藥物的敏感性試驗結(jié)果見表1。

表1 羊結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體對藥物的敏感性試驗結(jié)果

判定標(biāo)準(zhǔn)：無羊結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體存活的孔標(biāo)記為(-)，有羊結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體存活的孔標(biāo)記為(+)

本藥敏試驗中，血蟲凈、土霉素片、鹽酸左旋咪唑、復(fù)方新諾明、痢特靈和氨芐青霉素鈉對羊結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體的絕對致死濃度LC100分別為：0.195 mg/mL、0.391 mg/mL、3.125 mg/mL、12.5 mg/mL、50 mg/mL和50 mg/mL，丙硫苯咪唑和乳酶生在濃度小于50 mg/mL時對羊結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體無效，甲硝唑和中藥驅(qū)蟲凈散在濃度低至0.025 mg/mL時，仍然殺滅了全部的結(jié)腸小袋纖毛蟲。本試驗顯示，藥物治療結(jié)腸小袋纖毛蟲病時，甲硝唑治療效果優(yōu)于血蟲凈，這與劉翠等人的研究結(jié)果一致[9]。

2.5 藥物防治試驗結(jié)果 甲組病羊治療后第7天，除1只母羊仍有輕微腹瀉癥狀，1只4月齡羔羊死亡外，其余均無明顯癥狀，糞便飽和硫酸鋅漂浮法發(fā)現(xiàn)還有3只羊呈現(xiàn)陽性，糞便轉(zhuǎn)陰率為73.33%(11/15)，繼續(xù)治療6 d后，全部康復(fù)，治愈率為93.33%(14/15)。乙組病羊治療后第10天，有2只母羊仍有輕微腹瀉癥狀，其余均痊愈，且末出現(xiàn)死亡病例，糞便飽和硫酸鋅漂浮法發(fā)現(xiàn)還有3只羊呈現(xiàn)陽性，糞便轉(zhuǎn)陰率為80%(12/15)，繼續(xù)治療6 d后，全部康復(fù)，治愈率為100%(15/15)。結(jié)果可以看出，用甲硝唑和中藥驅(qū)蟲凈散治療羊結(jié)腸小袋纖毛蟲病，均取得顯著療效，但治療時一定要保證藥物的劑量和療程，確保糞便中羊結(jié)腸小袋纖毛蟲全部被殺死，防止疾病反復(fù)。

3 討論

3.1 糞便中羊結(jié)腸小袋纖毛蟲的分離、固定與染色 糞便中含有纖維素、細(xì)菌、蛋白質(zhì)、沙粒等異物，會影響羊結(jié)腸小袋纖毛蟲的制片和觀察的效果。新鮮糞便經(jīng)直接涂片發(fā)現(xiàn)羊結(jié)腸小袋纖毛蟲后，可采用生理鹽水1 500 r/min離心水洗3～5次，再用2.5%戊二醛固定，可以洗掉蟲體表面和纖毛上吸附的蛋白質(zhì)等異物。離心管中進(jìn)行染色、脫水后制片觀察，可以避免染色和脫水時，蟲體(特別是包囊)易脫落的現(xiàn)象。如染色過深，常規(guī)的做法是用1%鹽酸乙醇脫色，其脫色的時間很短，很難操作和控制，特別是在離心管中染色時更難，另外，脫色后蟲體顏色發(fā)灰發(fā)暗，很難染出色澤艷麗、層次分明的標(biāo)本，如采用反復(fù)水洗脫色，可達(dá)到理想的染色效果。

3.2 藥物對結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體的殺滅試驗 本試驗建立了羊結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體的藥物敏感性試驗方法，該方法將藥液在平底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行倍比稀釋，與等量的結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體培養(yǎng)懸液混合，28 ℃作用12 h，在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果，測定藥物的致死濃度(LC100)，該方法簡便、快捷、直觀和實用。臨床上也可以直接將新鮮糞便加液體培養(yǎng)基攪勻，糞網(wǎng)篩過濾，必要時進(jìn)行離心濃集，制成滋養(yǎng)體懸液進(jìn)行試驗，以選出獸醫(yī)臨床防治的有效藥物。

試驗結(jié)果顯示, 甲硝唑具有較好的抗羊結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體活性效果，可用作臨床的首選治療藥物，其次是血蟲凈和土霉素，這與抗豬結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體的試驗結(jié)果一致[9-10]。中藥驅(qū)蟲凈散對結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體的LC100濃度低至0.025 mg/mL，優(yōu)于其他常山、青蒿等中草藥制劑[11]，同時中藥驅(qū)蟲凈散具有抗線蟲、絳蟲和球蟲等活性，有廣闊的應(yīng)用前景。

3.3 羊結(jié)腸小袋纖毛蟲的藥物治療 目前，以甲硝唑為代表的硝基咪唑類藥物是抗滴蟲、阿米巴原蟲和結(jié)腸小袋纖毛蟲的首要選擇，但其具有潛在的致癌和致突變作用[12]，而且容易產(chǎn)生耐藥性，因此開發(fā)安全、有效、綠色的甲硝唑類藥物的替代品已成為必然。本文治療羊結(jié)腸小袋纖毛蟲的中藥驅(qū)蟲凈散以其廣譜、高效、安全的特點，有較高的推廣價值。本病治愈后，依然存在攝入結(jié)腸小袋纖毛蟲包囊的可能性，所以羊場一旦發(fā)生該病，就很難清除，要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，定期檢查和驅(qū)蟲，做到早診斷，早治療。

4 小結(jié)

通過臨床檢查，糞便實驗室檢驗和糞便水洗沉淀物染色鏡檢等措施，首次確診了以患嚴(yán)重腹瀉癥狀為特征的羊結(jié)腸小袋纖毛蟲病例，中西醫(yī)藥敏試驗和治療試驗發(fā)現(xiàn)，甲硝唑和中藥驅(qū)蟲凈散具有較好的治療效果，其中中藥驅(qū)蟲凈散綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生耐藥性，具有廣闊的應(yīng)用前景。