何小莉，梁海英，曾智勇，湯德元，王 彬，黃 濤，張愛瓊，咸 文

(貴州大學動物科學學院，貴州貴陽550025)

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒引起的一種高度接觸性傳染病，主要以新生仔豬的急性死亡以及4周齡以上仔豬出現(xiàn)神經癥狀，妊娠母豬繁殖障礙、流產、死胎及呼吸道癥狀為特征[1]。自1902年匈牙利首次發(fā)現(xiàn)該病以來已廣泛分布于世界各地，1974年傳入我國，至今全國已有 30多個省份發(fā)生流行，是嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一[2]。偽狂犬病病毒(Pseudorabiesviurs，PRV)屬皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，水痘病毒屬，雙鏈DNA病毒，全長約150 kb，基因組GC含量最高達73%，基因組編碼約100種蛋白質，成熟的病毒粒子約含有50種蛋白質[3]。gE和TK基因是PRV主要毒力基因，但不是病毒增殖所必需的。gE基因在促進感染細胞向鄰近非感染細胞融合，介導病毒在細胞間擴散起作用，TK基因所編碼的胸苷激酶與病毒在神經組織中增殖有關[4]。自2011年以來，由于變異毒株的出現(xiàn)導致豬偽狂犬病發(fā)生率逐漸上升，也給本省養(yǎng)豬業(yè)造成了一定的經濟損失。本試驗通過對貴州省某規(guī)?；i場疑似豬偽狂犬病發(fā)病豬進行病理剖檢病變觀察及PCR檢測，并對其主要毒力基因(gE、TK基因)進行克隆測序及遺傳進化分析，旨在為豬偽狂犬病的檢測及相關基因遺傳變異狀況提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 貴州省丹寨地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)殖場送檢的疑似PRV感染后發(fā)病死亡豬1頭。

1.2 試驗主要材料 大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，購自上海生工生物工程技術服務有限公司； pMD19-T載體、DL-2 000 Marker、DNA抽提試劑盒及LATaqDNA聚合酶，購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒，購自OMEGA公司。

1.3 引物 根據在GenBank中已發(fā)表的豬偽狂犬病毒PRV Fa株(KM189913.1)gE和TK基因序列，利用Oligo 5.0設計2對引物并委托TaKaRa公司合成，引物序列分別為gE-F1：5′-GGGGTACCATGCGGCCCTTTCTGCT-3′；gE-R1：5′-CCGGAATTCTTAAGCGGGGCGGGACAT-3′；TK-F2：5′-TTTGAATTCGCGGCACGTCTTGAGCTCGA-3′；TK-R2：5′-TTTAAGCTTCGCCGACCAGGACGAACAGG-3′。

1.4 病豬剖檢及病原檢測 無菌剖檢發(fā)病死豬，觀察其組織病理病變，適量取其心、肝、脾、肺、腎、腦等組織混合研磨，反復凍融3次后，取上清，用DNA抽提試劑盒提取核酸，用PRVgE特異性引物進行PCR檢測，反應結束后，分別取7 μL擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并記錄結果。

1.5 PRV GZDZ2016株gE和TK基因的克隆及序列分析 以組織核酸為模板進行PRVgE及TK基因的PCR擴增，分別將PCR產物純化回收后連接于pMD19-T 載體，轉入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，將重組質粒送深圳華大基因科技服務有限公司進行序列測定。用DNAStar軟件對PRV GZDZ2016株的測序結果與參考毒株的gE、TK基因的序列分別進行基因分子特征分析及核苷酸、氨基酸同源性分析，并用MEGA7.0繪制遺傳進化樹。

2 結果

2.1 剖檢病理變化及病原檢測結果 剖檢病死豬可見皮膚散布出血點(見中插彩版圖1)，脾臟表面有許多散在大小不一顆粒狀的白色壞死點(見中插彩版圖2)，肝臟出現(xiàn)大面積瘀斑、且表面有白色壞死灶(見中插彩版圖3)，肺臟有瘀斑且間質增寬(見中插彩版圖4)。將各組織器官經過處理后，提取核酸用PRVgE特異性引物進行檢測，結果顯示，病料中檢出PRVgE特異性核酸陽性條帶，且與預期大小相符。

2.2gE、TK全基因PCR擴增及鑒定gE、TK全基因PCR擴增結果顯示擴增片段大小與預期條帶相符，分別得到約1 800 bp和1 500 bp大小的目的條帶(圖5)。克隆質粒經雙酶切和PCR鑒定后，并將陽性重組質粒送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

2.3gE和TK基因序列分析

2.3.1gE基因分子特征分析gE基因的核苷酸序列分析結果顯示，PRV GZDZ2016株的gE基因序列與參考毒株核苷酸序列同源性在97.6%～99.9%，其中與HN1201、HXN、JX-2012、GA株的同源性最高；PRV GZDZ2016株的gE基因序列與參考毒株氨基酸序列同源性在95.7%～99.8%，氨基酸序列分析結果表明，PRV GZDZ2016株gE基因所編碼的氨基酸與PRV Fa標準株氨基酸序列相比，48位和496位均各有一個天冬氨酸(D)的插入，第236位由亮氨酸(L)變?yōu)楦彼?P)。

圖5 PRV GZDZ 2016株 gE、TK全基因序列的PCR擴增

遺傳進化樹結果顯示，gE基因的遺傳樹明顯分為2個大群。其中PRV GZDZ2016株與文獻報道的變異代表株處在于同一分支上，與國內早期的分離株共同構成一個亞群；國外的毒株形成另外一個大的分支，與國內的經典毒株相距較遠(圖6)，進一步說明了該毒株具有變異毒株特征，且與國外流行毒株和國內經典毒株的親緣關系較遠。

圖6 PRV GZDZ2016株gE基因遺傳進化樹

2.3.2TK基因分子特征分析TK基因的核苷酸序列分析結果顯示，PRV GZDZ2016株TK基因與疫苗株Bartha株的核苷酸相似性和氨基酸同源性分別為99.4%、98.8%；與國外的Becker、Kaplan、NIA3等株之間的核苷酸相似性和氨基酸同源性分別為99.4%～99.6%和98.8%～99.4%；與國內近幾年分離毒株JS-2012、HeN1、TJ等株之間的核苷酸相似性和氨基酸同源性分別為99.5%～99.8%和98.8%～99.4%；其中與HN1201、HeN1、JS-2012、TJ、HBCL-2012、BJ/YT株的同源性最高。氨基酸序列分析結果表明，TK基因所編碼的氨基酸則第6位氨基酸由異亮氨酸(I)變?yōu)楸彼?A)，第157位氨基酸由天冬氨酸(D)變?yōu)楦拾彼?G)。

遺傳進化樹結果顯示，TK基因可分為4個基因群，本研究的PRV GZDZ2016株與國內分離的大多數毒株構成基因1群，國內部分毒株與國外分離株構成另外3個基因群(圖7)。

圖7 PRV GZDZ2016株TK基因遺傳進化樹

3 討論

目前，豬偽狂犬病疫情形勢嚴峻，2012年以來在中國多個省份許多使用PRV基因缺失活疫苗進行免疫的規(guī)?；i場出現(xiàn)了豬狂犬病的流行，并從已免疫過疫苗的豬群分離到PRV變異毒株。gE和TK基因是PRV主要毒力基因，gE基因在促進感染細胞向鄰近非感染細胞融合，介導病毒在細胞間擴散起作用[5]；TK基因失活，則PRV對宿主的毒力喪失或顯著下降[6]。因此，對貴州省PRV臨床流行毒株的gE、TK基因的克隆分析，將有利于掌握貴州省PRV流行株的遺傳變異情況。

本研究通過病理剖檢、PCR鑒定及序列分析等方法，證實送檢發(fā)病豬由于感染PRV致死，并將該感染毒株命名為PRV GZDZ2016株。對該毒株gE全序列分析結果顯示，gE基因氨基酸的第48位和第496位各存在1個天冬氨酸(D)的插入，這兩個位點的變化與此前報道的HN1201[7]、TJ[8]等變異毒株具有相同的變異模式，表明 PRV GZDZ2016株為PRV變異毒株，同時第236位點出現(xiàn)L→P的突變，這個氨基酸位點位于gE抗原表位E區(qū)，該突變是否會對PRV的毒力或gE抗原性發(fā)生漂移尚需進一步研究。對該毒株TK基因的序列分析結果表明，最具特征性的是PRV GZDZ2016株TK基因核苷酸序列第17位和470位出現(xiàn)了獨特性的堿基突變，第17位由T→C，第470位由 A→G，并造成第6位氨基酸由 I→A 和第157位氨基酸由D→G。Darb等研究認為5-18aa區(qū)間為ATP結合位點，該區(qū)域對TK蛋白的催化功能十分重要[9]，上述PRV GZDZ2016株TK基因氨基酸序列第6 位氨基酸由I→A，因此，TK基因在該位點的突變可能會對 PRV 的毒力產生一定的影響。

基于PRV GZDZ2016株gE、TK基因系統(tǒng)進化樹分析結果顯示，PRV GZDZ2016株與2012年以來國內分離的PRV變異毒株及國內經典毒株的親緣關系較近，而與國外毒株的親緣關系相對較遠，綜上所述，本研究的PRV GZDZ2016株具有一定的當前PRV流行株的代表性，屬于PRV變異毒株。PRV GZDZ2016株的分子特征將對變異株的分子流行病學調查提供重要的參考，以更好地對豬偽狂犬病的診斷和防控提供科學依據。