馬保臣，董玉蘭，柴同杰

(1.中國牧工商集團(tuán)有限公司，北京豐臺(tái)100070 ； 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安271018 ；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193)

金黃色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的重要病原。近些年來，抗生素的廣泛應(yīng)用，金黃色葡萄球菌的抗菌譜逐漸擴(kuò)大，給臨床治療和預(yù)防金黃色葡萄球菌乳腺炎提出新的挑戰(zhàn)。研究證實(shí)，金黃色葡萄球菌感染關(guān)鍵的一步為纖維連接蛋白結(jié)合蛋白(Fibronectin-Binding Protein，F(xiàn)nBP)和宿主蛋白(例如纖連蛋白(Fibronectin protein，F(xiàn)n))之間形成的結(jié)合體，金黃色葡萄球菌FnBP與Fn形成吻合的結(jié)構(gòu)，F(xiàn)nBP蛋白在金黃色葡萄球菌的感染中發(fā)揮重要作用[1]。Herman-Bausier P(2015)通過耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染人的內(nèi)置設(shè)備證實(shí)，F(xiàn)nBPA(Fibronectin-Binding Protein A，F(xiàn)nBPA)在引起細(xì)菌粘附和形成細(xì)菌生物膜發(fā)揮重要作用[2]。本試驗(yàn)對(duì)奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌FnBPA基因進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)FnBPA基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)，用表達(dá)的蛋白制作蛋白疫苗進(jìn)行了動(dòng)物免疫，期望為研制奶牛金黃色葡萄球菌乳腺炎新型基因工程疫苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 337株金黃色葡萄球菌來自2002-2006年間本實(shí)驗(yàn)室從奶牛臨床乳腺炎和隱性乳腺炎病例的乳樣中分離鑒定。其中，臨床型乳腺炎金黃色葡萄球菌124株，隱性乳腺炎金黃色葡萄球菌213株。載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌DH5α，BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存；酶購自TaKaRa公司。核酸純化和質(zhì)粒提取試劑盒，購自U-gene公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2．1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank發(fā)表的Fnbp和Cnap序列，利用 Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)了FnBPA基因引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列為：FnBPA-F 5′-CT GGATCC GGCCAAAATAGCGGTAAC-3′；FnBPA-R 5′-CT CTCGAG TAAGCTTACTTTTGGAAGTGT-3′，其中，GGATCC為BamHΙ酶切位點(diǎn)，CTCGAG為XhoΙ酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增的片段長度為350 bp左右。

1.2.2 PCR模板DNA的獲取 參照文獻(xiàn)[3]

1.2.3 PCR以及最適反應(yīng)體系 DNA模板2 μL，F(xiàn)nbp-F 1 μL，F(xiàn)nbp-R(25 μmal/L/μL) 1 μL，dNTP 2 μL, MgCl24 μL, 10×PCR Buffer 5 μL,Taq酶 1 μL，ddH2O 34 μL。FnBPA基因擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min。94 ℃變性1 min, 47 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸7 min。Cnap基因擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min。94 ℃變性1 min,47 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸10 min。

1.2.4 克隆載體的構(gòu)建與鑒定 選取分離株擴(kuò)增出的350 bp DNA片段，純化、連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。將轉(zhuǎn)化的受體菌均勻涂布到含50 μg/mL氨芐青霉素(AMP)、X-gal 和IPGT的LB瓊脂平板中，從平板上挑取白色菌落，接種到含AMP的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)PCR和酶切雙重鑒定成功后，送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將菌株10A的FnBPA克隆載體質(zhì)粒進(jìn)行BamHΙ和XhoΙ雙酶切，將回收后的DNA片段定向插入至表達(dá)載體pET-32a的多克隆區(qū)，相關(guān)的酶切、片段回收、連接反應(yīng)以及轉(zhuǎn)化等操作都按照說明書進(jìn)行。將初選的陽性質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，將表達(dá)載體陽性質(zhì)粒命名為PET-FnBPA，送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.6 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)、純化、檢測(cè)和定量 將重組菌落接種于5 mL LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100 μg/mL)中，37 ℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長前期(OD值約為0.6)，加入1mol/L IPTG誘導(dǎo)4 h。取適量菌液離心集菌后進(jìn)行SDS-PAGE分析表達(dá)情況。表達(dá)菌體經(jīng)過反復(fù)凍融處理后，高速離心3 min，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，對(duì)表達(dá)蛋白用鎳離子親和樹脂進(jìn)行純化，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，純化蛋白用計(jì)算機(jī)掃描分析其純度。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后,進(jìn)行電轉(zhuǎn)移,然后進(jìn)行免疫檢測(cè)。將NC膜轉(zhuǎn)移至50 mL脫脂牛乳中，輕搖封閉1 h，洗膜；然后加入一抗(鼠抗FnBPA血清)，輕搖3 h，洗膜；加入二抗溶液(HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體封閉液)，輕搖3 h，洗膜；最后顯色，至條帶清晰后迅速用雙蒸水終止顯色。按照PIERCE公司的BCATM Protein Assay Kit操作，采用雙波長法進(jìn)行蛋白定量，純化后的蛋白使用低溫凍干機(jī)制成成品，動(dòng)物試驗(yàn)備用。

1.2.7 FnBPA蛋白疫苗的制備 FnBPA蛋白為所純化蛋白透析后的低溫凍干制品，本試驗(yàn)共需要30 mg純化蛋白，將其配制濃度為1 mg/1 mL。蛋白與完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑按照1∶1比例充分混合乳化后用于動(dòng)物免疫。

1.2.8 免疫奶牛 首先對(duì)5頭試驗(yàn)?zāi)膛?0314，0368，0288，0513，0445)進(jìn)行系統(tǒng)檢查，體溫正常，無傳染病，無外科疾病，年齡在3～6歲之間，無臨床型乳腺炎，正常產(chǎn)奶。對(duì)試驗(yàn)牛用CMT檢測(cè)各乳區(qū)乳樣無隱性乳腺炎，排除金黃色葡萄球菌感染。本試驗(yàn)用0314，0368，0288號(hào)奶牛用于免疫注射，0513，0445號(hào)牛用于對(duì)照(注射生理鹽水)。

1.2.9 免疫程序與方法 5頭試驗(yàn)牛免疫2次，時(shí)間間隔11 d，第一次采用臀部皮下多位點(diǎn)注射(5 mg 蛋白/只。弗氏完全佐劑乳化)；第二次采用臀部皮下注射(5 mg蛋白/只。弗氏不完全佐劑乳化)。對(duì)5頭試驗(yàn)牛分別在免疫0 d，10 d，20 d，30 d和40 d采集血樣。

1.2.10 間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià) 參照周宏(2005)[5]的方法。

2 結(jié)果

2.1 奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌的分子調(diào)查結(jié)果 對(duì)引起奶牛臨床型和隱性乳腺炎的337株金黃色葡萄球菌分別進(jìn)行FnBPA蛋白基因調(diào)查，51.04%(172/213)攜帶FnBPA蛋白基因，臨床型乳腺炎金黃色葡萄球菌FnBPA蛋白的攜帶率為68.5%(85/124)。

2.2 基因測(cè)序、重組表達(dá)載體質(zhì)粒的PCR與酶切鑒定 用于表達(dá)的菌株10A的FnBPA基因的序列被GenBank收錄，收錄編號(hào)為：DQ447162。選取分離株10A的FnBPA基因連接到pET-32a表達(dá)載體中，PCR與酶切結(jié)果見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒pET-Fnbp的PCR和雙酶切鑒定

M: DL：2 000 DNA Marker ； 1: 重組質(zhì)粒pET-FnBPA酶切；
2: 重組質(zhì)粒PET-FnBPA PCR

2.3 FnBPA蛋白的SDS-PAGE，檢測(cè)和定量 FnBPA蛋白SDS-PAGE顯示，蛋白在上清和沉淀中都存在，以上清中較多，主要以可溶形式分泌表達(dá)，經(jīng)鎳離子親和樹脂純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖2。純化蛋白經(jīng)計(jì)算機(jī)掃描分析，顯示其純度在95%以上。本試驗(yàn)共獲得FnBPA蛋白共計(jì)33 mg，定量結(jié)果為：2.8 mg/mL。

圖2 純化蛋白的SDS-PAGE

M: 蛋白分子量 ； 1，2: 純化后的蛋白

2.4 試驗(yàn)牛臨床體征以及免疫抗體測(cè)定 疫苗免疫注射后試驗(yàn)牛體溫測(cè)量發(fā)現(xiàn)，只有0288號(hào)牛注射后有體溫升高、采食量和產(chǎn)奶量減少，但3 d后恢復(fù)正常；其余試驗(yàn)牛體溫沒有明顯變化。圖3顯示了試驗(yàn)牛注射FnBPA蛋白疫苗后的抗體滴度變化，每10 d測(cè)定1次抗體，最高抗體滴度達(dá)到7 log2，各注射牛FnBPA抗體消長規(guī)律基本一致，免疫30～40 d后抗體達(dá)到高峰。

圖3試驗(yàn)牛FnBPA抗體滴度

3 討論

3.1FnBPA基因在奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌的存在情況 本試驗(yàn)對(duì)奶牛臨床型和隱性乳腺炎金黃色葡萄球菌的FnBPA基因調(diào)查，結(jié)果顯示，臨床型乳腺炎金黃色葡萄球菌具有較高的FnBPA基因攜帶率。Shinji H等(2011)[5]調(diào)查認(rèn)為，對(duì)于造成人嚴(yán)重感染的金黃色葡萄球菌，基本都有FnBPA蛋白參與作用，本試驗(yàn)中，分離的臨床型乳腺炎金黃色葡萄球菌FnBPA基因攜帶率高，可能是FnBPA蛋白在感染中起到更重要的作用。

3.2FnBPA基因的克隆與原核表達(dá) 本試驗(yàn)應(yīng)用PET融合表達(dá)系統(tǒng)對(duì)FnBPA基因進(jìn)行了高效表達(dá)，該系統(tǒng)具有強(qiáng)的T7 Lac核啟動(dòng)子，能高效表達(dá)外源蛋白，并且融合伴隨蛋白為短的融合型，對(duì)外源基因的影響較小。它在外源蛋白兩翼各融合表達(dá)一個(gè)6×His的標(biāo)簽，有益于外源蛋白的純化。本試驗(yàn)表達(dá)的融合蛋白以可溶性形式存在于胞漿中，有利于保持表達(dá)重組蛋白的天然結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)對(duì)奶牛乳腺炎分離株10A進(jìn)行了FnBPA蛋白的克隆與表達(dá)，經(jīng)過SDS-PAGE和Western-Blotting特異性檢測(cè)，證明獲得了高純度的FnBPA蛋白和該蛋白具有抗原性。

3.3 FnBPA蛋白疫苗免疫和前景 本試驗(yàn)充分證明了5 mg/頭FnBPA蛋白疫苗免疫注射后，在奶牛體內(nèi)能夠產(chǎn)生抗體，并且在5～6周達(dá)到峰值，說明該蛋白疫苗具有很好的抗原性。疫苗注射后試驗(yàn)牛除0288號(hào)牛出現(xiàn)了體溫升高和奶產(chǎn)量的變化外但很快康復(fù)，其他試驗(yàn)牛沒有發(fā)現(xiàn)異常，說明該蛋白疫苗安全性在可控范圍之內(nèi)。周宏(2005)[4]也證實(shí)，F(xiàn)nBPA 蛋白疫苗在0，2周和3周3次免疫小鼠后(100 μg/只·次)，抗體在2，4，6周的值分別為：2-4，2-7，2-10。宋戰(zhàn)輝(2014)[6]用金黃色葡萄球菌粘附相關(guān)蛋白免疫小鼠，也證實(shí)了有很好的免疫原性。何焱等(2014)[7]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，乳腺炎金黃色葡萄球菌基因工程亞單位疫苗的可行性。總之，金黃色葡萄球菌表面蛋白疫苗是未來金黃色葡萄球菌疫苗研制的新方向，但還要很多的工作需要完成。本試驗(yàn)中蛋白疫苗能否對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生保護(hù)還需要進(jìn)一步試驗(yàn)，包括金黃色葡萄球菌乳腺炎模型，乳清中的抗體消長規(guī)律，攻毒試驗(yàn)等將成為今后重要的研究內(nèi)容。