杜國強，王立銀，王曉鳳，李君，張明明，王瑾

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1. 耳鼻咽喉科； 2. 急診科； 3. 病理科，沈陽 110004）

喉鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中最常見的腫瘤，占全身惡性腫瘤的2%～3%，其發(fā)病率呈上升趨勢。目前盡管針對喉癌的治療手段有所改進(jìn)，但患者5年生存率并沒有顯著提高［1］。探究如何有效地評估喉癌治療效果及其預(yù)后一直是研究熱點。近年來，程序性死亡蛋白配體1 （programmed death ligand 1，PD-L1） 在腫瘤免疫治療中的地位受到廣泛關(guān)注，其與受體程序性死亡蛋白組成機體重要的免疫檢查點，可抑制T細(xì)胞的活化，參與腫瘤的免疫逃逸［2］。但其在腫瘤微環(huán)境中的調(diào)控機制尚不明確。脫嘌呤/脫嘧啶內(nèi)切核酸酶1 （apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1） 具有DNA損傷修復(fù)功能以及氧化還原功能，可以調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子，APE1在亞細(xì)胞的定位分布變化與腫瘤的增殖、浸潤和對放化療抵抗性有一定關(guān)系［3-4］。已有研究［5-8］表明，APE1和PD-L1在多種惡性腫瘤中共同參與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后，但在喉癌組織中未明確其相關(guān)性。本研究擬檢測PD-L1和APE1在喉癌中的表達(dá)情況，并初步探討其可能存在的相互作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機收集2013年2月至2015年12月中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科手術(shù)治療的60例喉鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤標(biāo)本，隨機選取其中30例的癌旁黏膜組織 （距腫瘤邊緣＞0.5 cm） 作為對照組?；颊吆聿磕[瘤切除范圍根據(jù)術(shù)前TNM分期和術(shù)中所見確定。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。標(biāo)本收集在術(shù)前征得患者同意，且通過倫理委員會批準(zhǔn)（倫理編號：2018PS56K） 。人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞系由中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室饋贈。

1.2 主要試劑

1640培養(yǎng)基、胎牛血清 （以色列BI公司）；Lipofectamine 2000 （美國Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑Trizol、SYBR （日本TaKaRa公司）；蛋白提取試劑盒、PDTC （中國碧云天公司）；兔抗人APE1、核因子κB （nuclear factor κB，NF-κB）、pNF-κB多克隆抗體 （英國Abcam公司）；兔抗人PD-L1多克隆抗體 （美國 CST公司）；鼠抗人Tubulin抗體、兔抗人GAPDH抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔 （鼠） 二抗 （中國中杉金橋公司）；ECL超敏發(fā)光液 （英國GE公司）；脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS；美國Sigma公司）；APE1-siRNA序列 （5’-GUCUGGUACGACUGGAGUA CC-3’，5’-UACUCCAGUCGUACCAGACCU-3’） （上海吉瑪公司） 。

1.3 實時定量PCR檢測喉癌以及癌旁組織APE1、PD-L1基因表達(dá)水平

Trizol提取組織內(nèi)總RNA，純度合格后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計引物：APE1上游引物5’-CAATACTGGT CAGCTCCTTCG-3’，下游引物5’-TGCCGTAAGAAA CTTTGAGTGG-3’；PD-L1上游引物5’-GCTGCACTA ATTGTCTATTGGGA-3’，下游引物5’-AATTCGCTTG TAGTCGGCACC-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物5’-GTC TCCTCTGACTTCAACAGCG-3’，下游引物5’-ACCAC CCTGTTGCTGTAGCCAA-3’。進(jìn)行定量分析，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)，收集信號?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量用2-ΔCt方法計算分析。每個樣本3個重復(fù)孔。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、APE1-siRNA轉(zhuǎn)染、LPS/PDTC干預(yù)

Hep-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)，48 h更換培養(yǎng)基1次。將狀態(tài)良好的Hep-2細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板，用無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約50%，更換Opti-MEM培養(yǎng)基。設(shè)置實驗組 （轉(zhuǎn)染APE1-siRNA） 、陰性對照組 （轉(zhuǎn)染Negative control-siRNA） 、空白對照組 （未干預(yù)） 。

脂質(zhì)體用量5 μL/孔，siRNA 5 μL/孔。轉(zhuǎn)染6 h后，更換為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將細(xì)胞接種于6孔板，以10%血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約80%后更換培養(yǎng)基。單純LPS干預(yù)組按濃度0、0.5、1、2、4 μg/mL加入LPS后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。單純PDTC組按濃度0、25、 50、100、200 μmol/L加入PDTC后繼續(xù)培養(yǎng)12 h。轉(zhuǎn)染+LPS組按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染步驟轉(zhuǎn)染24 h后加入LPS （濃度2 μg/mL） 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 Western blotting檢測APE1、 PD-L1、NF-κB、pNF-κB蛋白表達(dá)情況

按蛋白提取試劑盒說明提取總蛋白，高溫變性。樣品行SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶常溫封閉2 h后孵育一抗，其中anti-APE1（1∶500） 、anti-PD-L1 （1∶200） 、anti-NF-κB （1∶1 000）、anti-pNF-κB （1∶500） 、anti-tubulin （1∶10 000） 、anti-GAPDH （1∶10 000） ， 4 ℃搖床過夜。 二抗（1∶40 000） 常溫孵育2 h，顯影后用Image J軟件分析蛋白條帶灰度，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白灰度值進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測PD-L1、APE1基因在臨床樣本中的表達(dá)水平

2.1.1 PD-L1、APE1 mRNA的表達(dá)：在喉鱗癌組織中APE1、PD-L1基因表達(dá)顯著高于癌旁組織，有統(tǒng)計學(xué)差異 （P ＜ 0.05） 。利用Spearman相關(guān)分析顯示，APE1與PD-L1兩者基因表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系 （r = 0.37，P ＜0.01） 。見圖1。

2.1.2 PD-L1、APE1 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系：PD-L1 mRNA的表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與喉癌發(fā)生部位有關(guān)，聲門型喉癌組織中PD-L1 mRNA表達(dá)水平顯著高于聲門上型和聲門下型 （P ＜ 0.05） 。同時，喉癌組織中APE1 mRNA的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否具有相關(guān)性 （P ＜0.05） ，與腫瘤生長部位、分化程度、TNM分期無關(guān)。見表1。

圖1 RT-PCR檢測喉鱗狀細(xì)胞癌和癌旁黏膜中APE1和 PD-L1 mRNA表達(dá)Fig.1 APE1 and PD-L1 mRNA levels in laryngeal squamous cell carcinoma and normal tissues evaluated by RT-PCR

2.2 APE1-siRNA轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞對 APE1、PD-L1表達(dá)的影響

表1 PD-L1、APE1 mRNA表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Association of PD-L1 and APE1 mRNA expressions with clinicopathological features of laryngeal squamous cell carcinoma

Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染APE1-siRNA及NC-siRNA 48 h后，采用RT-PCR及Western blotting分別檢測APE1、PD-L1 mRNA及蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示APE1與PD-L1在Hep-2細(xì)胞中有表達(dá)，且實驗組與陰性對照組及空白對照組相比，APE1、PD-L1相對表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。見圖2。

圖2 沉默APE1基因后Hep-2細(xì)胞APE1、PD-L1 mRNA及蛋白表達(dá)的變化Fig.2 The changes in the expressions of APE1 and PD-L1 mRNA and protein in Hep-2 cells after siRNA transfection

2.3 APE1對PD-L1的影響依賴NF-κB信號通路

為探究APE1對PD-L1的表達(dá)是否存在調(diào)控機制，本研究進(jìn)一步在Hep-2細(xì)胞中沉默APE1基因的表達(dá)，檢測NF-κB、pNF-κB蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，實驗組與空白對照組、陰性對照組相比，NF-κB、pNF-κB蛋白表達(dá)量顯著下降 （圖3） 。予以不同濃度LPS干預(yù)Hep-2細(xì)胞，在一定濃度范圍內(nèi)，PD-L1、NF-κB蛋白表達(dá)較0濃度組逐漸增高 （圖4） 。以不同濃度PDTC干預(yù)Hep-2細(xì)胞，在一定濃度范圍內(nèi)，PDL1、NF-κb蛋白表達(dá)較0濃度組逐漸降低 （圖5） 。沉默APE1表達(dá)后給予LPS干預(yù)，NF-κB、PD-L1蛋白表達(dá)較未干預(yù)組減低，較單純LPS干預(yù)組顯著降低 （圖6） ，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。這些結(jié)果表明，APE1可能通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)。

圖3 沉默APE1基因后Hep-2細(xì)胞中NF-κB、pNF-κB及PD-L1蛋白表達(dá)的變化Fig.3 The changes in NF-κB，pNF-κB，and PD-L1 protein expression in Hep-2 cells after siRNA transfection

3 討論

圖4 激動NF-κB 信號通路提高PD-L1和NF-κB蛋白的表達(dá)Fig.4 The activation of the NF-κB signaling pathway is effective in improving PD-L1 and NF-κB expressions

圖5 抑制NF-κB 信號通路降低PD-L1和NF-κB蛋白的表達(dá)Fig.5 The inhibition of the NF-κB signaling pathway is effective in abolishing PD-L1 and NF-κB expression

圖6 NF-κB信號通路參與APE1對PD-L1的調(diào)節(jié)Fig.6 The NF-κB signaling pathway is involved in the regulation of PD-L1 by APE1

機體的免疫微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系［9］。對于免疫治療來說，尋找能夠評估腫瘤對免疫治療敏感程度的指標(biāo)及調(diào)控腫瘤細(xì)胞免疫檢查點表達(dá)的分子生物學(xué)通路，成為選擇適合免疫治療的患者和評估預(yù)后的關(guān)鍵問題。

PD-L1是主要表達(dá)于惡性腫瘤細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、T細(xì)胞的B7超家族蛋白。其受體程序性死亡蛋白1主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞。PD-L1與程序性死亡蛋白1+T細(xì)胞結(jié)合后，可通過激活免疫受體酪氨酸抑制基序 （ITIM） 使下游磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶（PI3K） 發(fā)生去磷酸化，阻斷PI3K-AKT通路的激活，阻礙活化T細(xì)胞的形成［2，10］。惡性腫瘤因發(fā)病部位、組織來源的不同，在其發(fā)生發(fā)展過程中可能形成相對特異的免疫微環(huán)境，因此對免疫相關(guān)治療的敏感程度也可能存在差異性。相關(guān)研究［11-12］顯示，多種類型的腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)情況反映了腫瘤免疫微環(huán)境活化的程度，并且與腫瘤患者對免疫治療敏感程度和患者的預(yù)后、生存率呈正相關(guān)。本研究表明，PD-L1在聲門型喉癌中的表達(dá)顯著高于聲門上型及聲門下型，APE1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移喉癌組織中明顯高表達(dá)，提示PD-L1與APE1參與了喉癌的進(jìn)展，且兩者可能存在互相調(diào)控關(guān)系。聲門區(qū)可能存在相對活躍的腫瘤免疫微環(huán)境，對免疫檢查點抑制劑類的免疫治療預(yù)后可能相對好于其他型喉癌。

APE1通過改變自身在惡性腫瘤細(xì)胞中的亞細(xì)胞空間定位，由核表達(dá)變?yōu)楹藵{共表達(dá)，調(diào)節(jié)包括NF-κB、AP-1、P53在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控多種蛋白的表達(dá)，影響了腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、凋亡以及對治療的耐藥性［13-15］。QING等［8］發(fā)現(xiàn)APE1、PD-L1在胃癌中普遍高表達(dá)，并存在相關(guān)性，可共同作為評估胃癌發(fā)生的危險因素及預(yù)測其預(yù)后的標(biāo)志物。本研究顯示，在喉癌組織中APE1與PD-L1基因較癌旁組織高表達(dá)且呈正相關(guān)。進(jìn)一步沉默人Hep-2細(xì)胞APE1基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白的表達(dá)隨著APE1蛋白表達(dá)的抑制而降低，驗證了在喉鱗狀細(xì)胞癌中APE1可能對PD-L1存在正向調(diào)控作用。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是Rel蛋白家族成員，參與了腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移［16］。既往研究［17-18］顯示，NF-κB活性受到抑制時PD-L1的表達(dá)相應(yīng)下降，提示NF-κB轉(zhuǎn)錄因子參與PD-L1的表達(dá)調(diào)控。本研究通過抑制或激動Hep-2細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)，正向調(diào)節(jié)PD-L1的蛋白表達(dá)。同時，沉默APE1表達(dá)后，Hep-2細(xì)胞中NF-κB、pNF-κB的表達(dá)顯著降低。APE1表達(dá)沉默后的細(xì)胞給予NF-κB激動劑處理后，發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白水平的表達(dá)無明顯增高。以上結(jié)果提示，APE1可能通過NF-κB通路調(diào)節(jié)PD-L1表達(dá)。

綜上所述，在喉鱗狀細(xì)胞癌中PD-L1和APE1表達(dá)增高，兩者參與了喉癌的發(fā)展。本研究顯示PD-L1表達(dá)與喉癌發(fā)生部位相關(guān)，聲門型喉癌患者可能在免疫相關(guān)治療中更加獲益。APE1可能通過NF-κB通路對喉癌細(xì)胞PD-L1基因表達(dá)實行調(diào)控，但這仍需通過大量基礎(chǔ)研究在更多的腫瘤類型中進(jìn)一步證實。