柴芳，李巖，劉克毅，李強(qiáng)

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121001）

我國因肝炎高發(fā)導(dǎo)致肝癌發(fā)病率居高不下，進(jìn)而成為世界上肝癌發(fā)病率最高的國家［1］。目前肝癌的治療方式仍以手術(shù)治療為主，術(shù)后的高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移一直是制約患者5年生存率的重要因素［2］。因此，揭示肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，找尋有效的治療手段是目前改善肝癌預(yù)后的關(guān)鍵。

長鏈非編碼 RNA （long non-coding RNA，lncRNA）是長度＞200 個核苷酸的非編碼 RNA，可以在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而參與多種病理生理過程［3］。伴隨對lncRNA認(rèn)識的深入，越來越多的證據(jù)顯示lncRNA在腫瘤相關(guān)基因調(diào)控過程中扮演重要作用，MEG3、HULC、HOTAIR等基因相繼被證實在肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及診斷、治療中的作用，說明lncRNA在肝癌進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［4-6］。X 染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本 （X inactive specific transcript，XIST） 被證實與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而且 XIST在不同腫瘤中發(fā)揮著不同作用，在肝癌中的作用尚未完全闡釋清楚［7-8］。本研究通過實時PCR檢測 XIST在肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞中的表達(dá)，并進(jìn)一步通過細(xì)胞檢測探討XIST在肝癌細(xì)胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌細(xì)胞系 HepG2、BEL-7402、SMMC-7721、Huh-7以及正常肝細(xì)胞均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。DMEM 培養(yǎng)基、血清購于逍鵬生物公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000 購于美國Invitrogen 公司，過表達(dá)質(zhì)粒購于吉凱公司，siRNA購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 實時PCR：按說明書提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為 20 μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為 25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 保存。以18 S作為內(nèi)參，實時PCR反應(yīng)采用20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：肝癌細(xì)胞系 HepG2、BEL-7402、SMMC-7721、Huh-7以及正常肝細(xì)胞置于含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，胰酶消化傳代。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：按照試劑說明書，取處于對數(shù)生長期細(xì)胞，待細(xì)胞生長密度約為60%時用于轉(zhuǎn)染，經(jīng)LipofectamineTM3000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后孵箱內(nèi)繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng) 48 h，收集細(xì)胞用于實驗檢測。

1.2.4 Transwell小室遷移實驗：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，每個Transwell小室的上室加入 5×104細(xì)胞，下室加入 500 μL含 10% 胎牛血清的培養(yǎng)液，加入時避免氣泡的產(chǎn)生。置于孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，棄上室中培養(yǎng)液，PBS洗 3 次，4% 多聚甲醛固定 20 min。用棉簽吸去上室內(nèi)液體，1% 結(jié)晶紫染液室溫下染色 10 min，PBS 洗 3 次，顯微鏡下每孔隨機(jī)取 5 個視野拍照。每組細(xì)胞均設(shè) 3 個復(fù)孔，實驗重復(fù) 3 次。

1.2.5 Transwell小室侵襲實驗：將預(yù)冷的 Matrigel膠與無血清培養(yǎng)基按 1∶8 比例稀釋，將膠鋪于Transwell小室上下室之間，每孔 80 μL均勻包被于Transwell小室底部膜內(nèi)，置培養(yǎng)箱 60 min 使之成膠。其余步驟同遷移實驗。

1.2.6 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性：常規(guī)胰酶消化細(xì)胞，按照每孔 3 000個細(xì)胞將細(xì)胞轉(zhuǎn)接到96孔板中，每組5 個復(fù)孔。96孔板置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72 h在每孔加入10 μL CCK-8溶液后在孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育約2 h。酶標(biāo)儀測量各孔的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 XIST在肝細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

實時PCR檢測 XIST在正常肝細(xì)胞 （LO2）和肝癌細(xì)胞系 （HepG2、BEL-7402、SMMC-7721、Huh-7） 中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞比較，XIST在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)高于正常肝細(xì)胞，其中SMMC-7721細(xì)胞中XIST表達(dá)升高最明顯，HepG2細(xì)胞中XIST表達(dá)較低，故選擇此2種細(xì)胞系作為實驗對象，見圖1。

圖1 XIST在正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 Expression of XIST in normal and hepatoma cell lines

2.2 過表達(dá)與RNA 干擾技術(shù)對XIST在肝癌細(xì)胞中表達(dá)的影響

通過過表達(dá)質(zhì)粒以及siRNA在細(xì)胞中過表達(dá)或敲低 XIST的表達(dá)來驗證XIST在肝癌中的作用，實時PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染過表達(dá)XIST質(zhì)粒能夠顯著增加XIST在肝癌細(xì)胞HepG2中的表達(dá) （圖2A） 。轉(zhuǎn)染了si-XIST后SMMC-7721細(xì)胞中 XIST 的表達(dá)明顯降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） （圖2B） 。以上結(jié)果提示過表達(dá)與敲除技術(shù)可用于后續(xù)實驗對 XIST的敲除與過表達(dá)。

2.3 XIST對肝癌細(xì)胞增殖的影響

既往研究［9-11］提示XIST在不同腫瘤中既可以發(fā)揮癌基因作用，又可以充當(dāng)抑癌基因作用。CCK-8實驗結(jié)果提示HepG2細(xì)胞中過表達(dá)XIST后細(xì)胞增殖活力顯著增強(qiáng)，SMMC-7721細(xì)胞中敲低 XIST表達(dá)后細(xì)胞增殖活力顯著受到抑制，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，見圖3。

圖2 過表達(dá)與RNA 干擾技術(shù)對XIST表達(dá)的影響Fig.2 Effects of overexpression and RNA interference on XIST expression

2.4 XIST對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

通過Transwell實驗檢測XIST對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞過表達(dá) XIST后侵襲與轉(zhuǎn)移能力均增強(qiáng)，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。SMMC-7721細(xì)胞中敲低 XIST表達(dá)后肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯抑制，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，見圖4。

圖3 XIST對肝癌細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of XIST on the proliferation of the hepatocellular carcinoma

3 討論

肝癌是世界范圍內(nèi)致死率極高的疾病，近年發(fā)病率持續(xù)增加［1］。雖然近年放療、化療以及分子靶向治療取得了長足的進(jìn)展，但是治療效果仍不理想，其主要原因與就診時已屬晚期，以及術(shù)后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)，因此，尋找有效的干預(yù)手段是目前研究的重點(diǎn)。

隨著對腫瘤認(rèn)識的深入，機(jī)體內(nèi)大量的非編碼RNA （miRNA、lncRNA、circular RNA、snRNA 等） 在腫瘤進(jìn)展中的重要作用漸漸被人們認(rèn)識，尤其是lncRNA在腫瘤中的作用受到越來越多的關(guān)注［3］。XIST是哺乳動物體內(nèi)X 染色體失活的主要調(diào)節(jié)基因，大量研究證實 XIST在分化、增殖等多方面均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。尤其是XIST的表達(dá)與腫瘤之間的關(guān)系日益受到關(guān)注［8］。CHEN 等［13］研究發(fā)現(xiàn)XIST在胃癌組織中高表達(dá)，同時抑制XIST的表達(dá)后胃癌細(xì)胞的增殖，侵襲轉(zhuǎn)移能力受到抑制。WANG等［14］研究證實在肺癌中XIST缺失能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖與侵襲。YILDIRIM 等［15］研究卻證實XIST在小鼠血液腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。那么，XIST在肝癌中的作用值得進(jìn)一步探討。

圖4 XIST對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響 ×100Fig.4 Effects of XIST on the invasion and metastasis of the hepatocellular carcinoma ×100

本研究實時PCR檢測XIST在正常肝細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果提示XIST在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)較正常肝細(xì)胞中明顯升高，提示XIST可能參與了肝癌的發(fā)生。同時，結(jié)果還提示在肝癌細(xì)胞系 SMMC-7721中表達(dá)最為顯著，在肝癌細(xì)胞系 HepG2中的表達(dá)不顯著，因此選擇這兩種細(xì)胞系作為研究對象。為了驗證XIST對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響，本研究通過在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)XIST與敲低XIST的表達(dá)以驗證其功能。本研究顯示在肝癌細(xì)胞 HepG2過表達(dá)XIST后細(xì)胞的增殖活力顯著增強(qiáng)，而在肝癌細(xì)胞 SMMC-7721細(xì)胞中敲低XIST的表達(dá)后肝癌細(xì)胞的增殖活力受到明顯抑制，說明XIST能夠調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖，參與了肝癌的進(jìn)展。同時通過Transwell實驗檢測XIST對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞HepG2過表達(dá)XIST后細(xì)胞的侵襲與遷移能力顯著增強(qiáng)，在肝癌細(xì)胞 SMMC-7721細(xì)胞中敲低XIST表達(dá)后，細(xì)胞侵襲與遷移能力受到抑制，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜0.05） ，提示XIST能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，參與了肝癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

綜上所述，XIST能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，提示XIST作為肝癌治療的有效靶點(diǎn)有望減緩肝癌的進(jìn)展，減少肝癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究基于細(xì)胞水平，更多XIST發(fā)揮作用的確切機(jī)制以及在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用還需要更多的實驗來證實。