林莉，殷典賀，韓丹，侯剛，尹燕，康健，王秋月

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，呼吸疾病研究所，沈陽 110001）

慢性阻塞性肺疾病 （簡稱慢阻肺） 是一種可以預(yù)防和治療的常見疾病，其特征是持續(xù)的呼吸道癥狀和氣流受限，氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，伴有氣道和肺對有害顆?；驓怏w所致的慢性炎癥反應(yīng)的增加［1］。慢阻肺的主要病理改變之一是肺氣腫，吸煙是慢阻肺發(fā)病的主要危險因素，大約90%的慢阻肺是吸煙導(dǎo)致［2］。除了炎癥，吸煙引起的氧化應(yīng)激在慢阻肺的發(fā)生、發(fā)展中也起到重要作用，大量研究［3］表明，慢阻肺患者機(jī)體氧化應(yīng)激水平增加，同時，氧化應(yīng)激還可以加重慢阻肺患者的肺部炎癥反應(yīng)。熊果酸又名烏索酸、烏蘇酸，廣泛分布于自然界許多植物中，已有研究［4］結(jié)果表明，熊果酸具有抗炎、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、延緩動脈粥樣硬化形成、改善糖尿病患者胰島細(xì)胞功能等藥理作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸除了上述作用外，還可以抗氧化及自由基清除活性，但熊果酸對香煙煙霧所致肺氣腫及氧化應(yīng)激的影響目前尚無文獻(xiàn)報道，本研究初步探討了熊果酸對煙熏所致大鼠肺氣腫及氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：雄性SPF級Wistar大鼠 （中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心） 24只，12周齡，平均體質(zhì)量（180±20） g，實驗室恒溫 （24±2） ℃，相對濕度40%。

1.1.2 主要試劑：熊果酸 （天津馬克生物技術(shù)有限公司） ，超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶 （catalase，CAT） 試劑盒、 （glutathione peroxidase，GSH-Px） 試劑盒、丙二醛 （malonaldehyde，MDA） 試劑盒 （南京建成生物工程研究所） ，8-異前列腺素F2α （8-iso-prostaglandinF2α，8-iso-PGF2α） ELISA試劑盒 （美國RD公司進(jìn)口分裝） ，8-羥基脫氧鳥苷 （8-hydroxy-2deoxyguanosine，8-OHdG） 抗體（英國Abcam生物技術(shù)公司） ，二抗 （中杉金橋生物技術(shù)公司） 。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的制備和分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分對照組、模型組和熊果酸組，每組8只。對照組：標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)大鼠12周，每日放入自制玻璃箱 （0.8 m×0.6 m×0.6 m，頂部有2 cm×2 cm的通氣孔） 內(nèi)1 h （上、下午各30 min，間隔4～6 h） ，不進(jìn)行熏煙，下午每次放入前半小時用生理鹽水10 mL/ （kg·d） 灌胃；模型組：每日將大鼠放入煙熏箱中用實驗用香煙 （紅金龍香煙，焦油量12 mg，煙堿量1.1 mg） 熏煙1 h （上、下午各30 min，間隔4～6 h） ，每次12支香煙，每周6 d，連續(xù)12周，每天下午熏煙前半小時用生理鹽水10 mL/ （kg·d） 灌胃；熊果酸組：每天下午煙熏前半小時給大鼠用熊果酸10 mL/ （kg·d） 灌胃，其余條件同熏煙組。

1.2.2 樣品的采集與處理：實驗12周后采用放血法處死大鼠。留取眼血，凝固后4 ℃離心 （3 000 r/min，10 min） ，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∽蠓纬Ｒ?guī)多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片 （厚5 μm） ，蘇木素-伊紅 （HE） 染色病理切片，顯微鏡下觀察大鼠肺氣腫情況。

1.2.3 肺氣腫評分：測量肺泡平均內(nèi)襯間隔 （mean linear intercept，MLI），在MetaMorph/UIC/US病理圖像分析系統(tǒng)視野正中劃“十”字交叉，計數(shù)通過該十字的肺泡間隔數(shù) （numbers，Ns） ，測得十字線總長度（length，L） ，MLI=L/Ns，其數(shù)值反應(yīng)肺泡平均直徑；計數(shù)平均肺泡數(shù) （mean alveolar numbers，MAN），測MetaMorph/UIC/US病理圖像分析系統(tǒng)下每個視野面積，計數(shù)該視野的肺泡數(shù)目，MAN = 該視野肺泡數(shù)目/該視野面積，其數(shù)值反映平均肺泡密度。

1.2.4 免疫組化法檢測肺組織8-OHdG表達(dá)：石蠟切片脫蠟至水。3% H2O2室溫孵育5 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。PBS浸洗5 min/次，共3次。10% BSA室溫孵育30 min。8-OHdG一抗 （1∶100） 于4 ℃冰箱中孵育過夜，后室溫復(fù)溫45 min。PBS浸洗5 min/次，共3次。山羊抗兔二抗 （1∶500） ，37 ℃孵育30 min。PBS浸泡5 min/次，共3次。顯色劑顯色3～15 min （DAB） ，顯微鏡下觀察，自來水充分沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察，拍照。

1.2.5 氧化-抗氧化指標(biāo)的測定：采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD的活性；采用比色法測定CAT和GSHPx的活性；采用ELISA法測定8-iso-PGF2α的濃度；采用TBA法測定MDA的濃度。所有操作均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理學(xué)改變及肺氣腫嚴(yán)重程度比較

對照組大鼠肺組織及氣道壁結(jié)構(gòu)清晰、氣道上皮排列整齊，肺泡大小、分布基本均勻、肺泡腔內(nèi)無滲出液。與對照組比較，模型組大鼠肺組織體積增大，表面不平，光鏡下病理學(xué)觀察示肺泡腔擴(kuò)大、部分肺泡間隔斷裂、肺泡腔融合、肺氣腫形成，氣道上皮排列紊亂、部分脫落、局部上皮增生、管壁增厚、管腔變小、周圍炎癥細(xì)胞浸潤并伴有細(xì)支氣管管壁平滑肌增生、管壁平滑肌部分?jǐn)嗔选⒈瓲罴?xì)胞增生等改變。熊果酸組肺組織體積輕度增大，表面尚平整，光鏡下病理學(xué)觀察示肺泡腔呈局部輕度擴(kuò)大，肺泡間隔略增寬，少量炎癥細(xì)胞浸潤，可見局部輕度肺氣腫形成 （圖1） 。模型組MLI明顯高于對照組和熊果酸組，MAN明顯低于對照組和熊果酸組，熊果酸組MLI和MAN與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2 各組大鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px活性和8-iso-PGF2α含量的比較

圖1 肺組織切片HE染色 ×20Fig.1 HE staining of lung tissues of rats ×20

表1 各組大鼠MLI、MAN比較 （ ±s，n = 8）Tab.1 Comparison of the MLI and MAN of rats from each group（ ±s，n = 8）

表1 各組大鼠MLI、MAN比較 （ ±s，n = 8）Tab.1 Comparison of the MLI and MAN of rats from each group（ ±s，n = 8）

Compared with model group，1） P ＜ 0.01. MLI，mean linear intercept；MAN，mean alveolar numbers.

Group MLI （μm）MAN （mm-2）Control 28.29±2.041） 319.91±11.731）Model 56.26±3.69 154.71±16.72 Ursolic acid 31.70±2.621） 300.37±21.091）F 228.10 226.87 P＜0.01 ＜0.01

模型組大鼠血清中的SOD、CAT、GSH-Px活性明顯低于對照組，而熊果酸組血清SOD、CAT、GSHPx活性明顯高于模型組，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異；模型組大鼠血清中8-iso-PGF2α含量明顯高于對照組、低于熊果酸組，而熊果酸組與對照組比較差異不明顯，見表2。

2.3 各組大鼠肺組織勻漿上清液中MDA的表達(dá)

模型組大鼠肺組織勻漿上清液的MDA表達(dá)明顯較對照組升高，而給予熊果酸干預(yù)后大鼠的肺組織勻漿上清液中MDA的表達(dá)明顯下調(diào)，見圖2。

表2 各組大鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px活性和8-iso-PGF2α含量測定 （ ，n = 8）Tab.2 Detection of SOD，CAT，and GSH-Px activity and 8-iso-PGF2α content in the serum of rats from each group （ ，n = 8）

表2 各組大鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px活性和8-iso-PGF2α含量測定 （ ，n = 8）Tab.2 Detection of SOD，CAT，and GSH-Px activity and 8-iso-PGF2α content in the serum of rats from each group （ ，n = 8）

Compared with model group，1） P ＜ 0.05.

GroupSOD （U/mL）CAT （U/mL）GSH-Px （μmol/L）8-iso-PGF2α（pg/mL）Control 229.52±10.371） 21.16±6.491） 769.32±175.651） 9.15±1.511）Model 217.10±11.33 15.38±3.82 542.84±170.37 11.12±1.58 Ursolic acid 231.67±10.051） 21.91±3.381） 787.05±244.621） 8.92±2.451）F 4.42 4.51 3.72 3.55 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.4 各組大鼠肺組織8-OHdG含量的比較

模型組大鼠肺組織8-OHdG表達(dá)與對照組比較明顯增加，而給予熊果酸干預(yù)后8-OHdG表達(dá)明顯降低，而熊果酸組與對照組比較差異不明顯，見圖3。

3 討論

圖2 各組別大鼠肺組織勻漿上清液中MDA的表達(dá) （，n = 8）Fig.2 Expression of MDA in the supernatant of lung tissue homogenate of rats from each group （，n = 8）

氧化應(yīng)激是指機(jī)體活性氧的生成過多和 （或）抗氧化能力降低，氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡紊亂，從而導(dǎo)致?lián)p傷的病理過程。機(jī)體內(nèi)抗氧化酶是一類在機(jī)體組織細(xì)胞內(nèi)具有極高的相對特異性、協(xié)同構(gòu)成阻止活性氧自由基損傷機(jī)體防御體系的重要酶，主要包括SOD、CAT、GSH-Px等。內(nèi)源性抗氧化酶在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增加可以減輕機(jī)體的氧化損傷［5］。8-iso-PGF2α是經(jīng)自由基催化不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化后的終末產(chǎn)物，8-OHdG為氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA損傷指標(biāo)，兩者產(chǎn)生與機(jī)體氧化應(yīng)激損傷關(guān)系極為密切，是評價氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)最有效的生物指標(biāo)［6-7］。

圖3 各組大鼠肺組織8-OHdG的表達(dá) （n = 8）Fig.3 Expression of 8-OHdG in lung tissue of rats from each group （n = 8）

慢阻肺的發(fā)生發(fā)展與炎癥、氧化應(yīng)激、蛋白酶和抗蛋白酶的失衡以及自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂等密切相關(guān)。肺氣腫和慢性支氣管炎是慢阻肺主要的病理改變。氧化應(yīng)激是加重慢阻肺患者肺部炎癥的重要機(jī)制。吸煙被認(rèn)為是導(dǎo)致慢阻肺氧化應(yīng)激的主要危險因素之一［8-9］。WASEEM等［10］研究證明，吸煙者血漿中的抗氧化酶SOD、CAT、GPX的活性顯著低于不吸煙者，MDA含量顯著高于不吸煙者，因此提高慢阻肺患者機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性可以降低肺組織的氧化應(yīng)激性損傷。臨床上也證明了應(yīng)用抗氧化劑如N-乙酰半胱氨酸、羧甲司坦等可以降低慢阻肺反復(fù)加重的頻率［11-13］。

熊果酸是廣泛分布于自然界許多植物中的一種三萜類化合物，已證實在氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病中具有較好的抗氧化作用［14-16］，可以增加抗氧化酶活性，減輕活性氧自由基引起的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等氧化應(yīng)激性損傷。本研究結(jié)果顯示，煙熏致肺氣腫組大鼠肺氣腫形成的同時，血清中酶性抗氧化物SOD、CAT、GSH-Px的活性明顯降低，而血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)8-iso-PGF2α的含量明顯升高。肺組織中脂質(zhì)過氧化指標(biāo)MDA及氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA損傷指標(biāo)8-OHdG表達(dá)升高，上述結(jié)果均提示肺氣腫大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。熊果酸組大鼠煙熏前半小時給予熊果酸灌胃治療，12周后觀察到大鼠氣道炎癥及肺氣腫的嚴(yán)重程度明顯減輕，提示熊果酸可以明顯降低香煙煙霧對大鼠肺組織的損傷，減輕肺氣腫。本研究結(jié)果顯示，熊果酸組大鼠血清中SOD、CAT、GSHPx的活性較模型組明顯升高，8-iso-PGF2α的含量明顯降低，肺組織中MDA與8-OHdG表達(dá)降低，提示熊果酸對大鼠的保護(hù)作用機(jī)制可能與減輕煙霧所致氧化應(yīng)激有關(guān)。熊果酸通過提高大鼠血清中抗氧化物酶的活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的含量，減輕煙霧對肺組織的損傷，只是其作用機(jī)制之一，可能熊果酸的抗炎作用也參與其中，這有待進(jìn)一步研究。

本研究初步觀察到熊果酸對煙熏所致肺氣腫大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，為進(jìn)一步研究熊果酸在慢阻肺中的作用及機(jī)制，進(jìn)而為慢阻肺治療藥物的開發(fā)及研究奠定了基礎(chǔ)。