吳玉芹 奎莉越 趙曉芬 李楊方 崔珊 杜琨

新生兒感染性疾病是發(fā)生在嬰幼兒時期的一類常見疾病，包括腸炎、黃疸、新生兒肺炎、尿布性皮炎等多種感染性疾?。?］。新生兒感染性疾病中，新生兒肺炎、腸炎這類感染性疾病的發(fā)生率及致死率均較高，早期診斷并進行相應的干預和治療能夠顯著地改善預后，提高患者的生存率［2］。但是新生兒各種感染性疾病早期的臨床癥狀各不相同，多數(shù)癥狀并不典型，常規(guī)檢測并不能在早期就靈敏的診斷出新生兒感染性疾病，再加上新生兒早期的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，自身對外界環(huán)境的抵抗力極差，導致感染疾病后，死亡率很高。因此，早期診斷和及時治療是決定新生兒感染性疾病預后和生存率的關鍵，探索早期可靠、靈敏、特異的診斷新生兒感染性疾病的標志物，對于降低新生兒感染性疾病的死亡率至關重要［3］。

C-反應蛋白（C reactive protein，CRP）是目前新生兒感染性疾病中研究的最廣泛也是最多的一種急性時相反應蛋白標記物［4］。當機體處于急性狀態(tài)時如機體受到感染或者組織受到損傷時，CRP的合成會短時間內(nèi)迅速增加，在36～50 h可達到高峰，含量能夠達到正常值的100～1 000倍，因此可以通過檢測患者血液中的CRP含量，初步判斷患者是否受到感染［5］。血清淀粉酶A蛋白（serum amyloid A，SAA）也是一種在急性時由肝臟分泌的相反應蛋白，屬于脂蛋白家族［6］。正常情況下，SAA在健康人血液中含量較低，而新生兒的SAA水平大部分分布在能夠檢測水平的最低值。有研究表明，在炎癥和組織損傷時，SAA明顯升高，急性感染病人增高幅度能夠較準確的反映病情嚴重程度，能夠作為感染性疾病炎癥的標志［6］。中性粒細胞表面抗原CD64（neutrophil CD64，CD64）是一種免疫球蛋白，是IgG的Fc段受體，其相對分子質量為72 000。正常情況下，CD64大部分分布在外周血的巨噬細胞、單核細胞及樹突狀細胞表面，在中性粒細胞表面水平較低。當受到粒細胞集落刺激因子及細菌細胞壁中的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等刺激時，CD64能夠迅速在中性粒細胞表面大量表達，同時能夠提高氧化代謝和脫顆粒水平，新生兒被細菌感染時CD64含量升高尤為明顯［7-8］。因此，本研究擬通過探討CRP、SAA及CD64在新生兒感染性疾病早期的表達規(guī)律，為新生兒感染性疾病的早期診斷和及時治療提供科學依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年5月至2017年5月在昆明市兒童醫(yī)院新生兒監(jiān)護病房住院的新生兒疑似感染病例100例，遵循以下入選標準：日齡大于5 d，小于40 d的新生兒，入院時具有如體溫升高、腹瀉、黃疸、少吃、少哭、嘔吐、皮膚黏膜局部感染、泌尿系統(tǒng)感染和感染性休克等疑似感染的臨床表現(xiàn)。同時，選取20例相同時期入院，具有相似日齡及胎齡的非感染性疾病（其中新生兒呼吸窘迫綜合征5例、母乳性黃疸4例、胃腸功能紊亂7例、頭顱血腫4例）新生兒作為對照組。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料

2組患者中感染組100人，其中男性58例，女性42例，對照組20人，其中男性14例，女性6例。感染組和對照組新生兒胎齡分別為（29.3±3.2）周和（30.1±2.4）周，采血日齡為（14.3±1.8）d和（15.4±2.1）d，出生體重為（3.31±0.42）kg和（3.27±0.43）kg。比較2組患者資料，發(fā)現(xiàn)2組患者在性別、胎齡、采血日齡和出生體重方面均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。詳細記錄所有被選入的研究對象入院以后的易感因素、臨床癥狀等，并檢測白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞以及CRP5項非特異性指標。

表1 2組新生兒的臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data in neonates

1.2.2 標本收集

各組患兒均在治療前，通過靜脈采血2 mL，其中1 mL靜置2 h待其凝血后，以3 000 r/min離心10 min，分離得到的血清，于-80℃冰箱保存，待檢測CRP及SAA，另1 mL置于含25 U/mL肝素鈉的抗凝血管中，用于檢測CD64的水平［7］。

1.2.3 CRP的檢測

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附反應試劑盒（英國Abcam公司，貨號：ab181416）檢測血清CRP含量。操作嚴格按照試劑盒說明書進行，以≥8 mg/mL為陽性［9］。

1.2.4 SAA測定

采用奧普Qpad金標數(shù)碼定量分析儀測定SAA的含量，奧普SAA-SPOT試劑盒購自上海奧普生物醫(yī)藥有限公司，操作嚴格按照操作說明書進行。

1.2.5 CD64測定

流式細胞分析儀檢測中性粒細胞表面抗原CD64的含量。取全血50 μL加上20 μL CD64 PE/CD45 Percp抗體（美國BD公司）混勻，暗處放1 h后加FACS溶血劑2 mL，避光放置20 min后用流式細胞儀（美國BD公司FACS Calibur）檢測CD64的含量［7］。

1.3 統(tǒng)計方法

采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以百分比表示，計量資料采用均數(shù)±標準差的方式表示；2組間計量資料的分析采用t檢驗，相關性分析采用Pearson檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 感染組和對照組血清CRP和SAA水平比較

2組患者中，感染組的CRP為（24.48±21.13）mg/L，而對照組的CRP為（5.12±2.21）mg/L，感染組的CRP的水平顯著高于對照組的水平。同樣，2組患者中，感染組的SAA水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表2）。

表2 感染組和對照組血清CRP和SAA水平比較Table 2 Comparison of CRP and SAA in the serum between the infected group and the control one

圖1 CD64的流式分析直方圖Figure 1 Histogram of CD64 by flow cytometry

2.2 感染組和對照組全血CD64水平比較

流式細胞儀CD64檢測通過單參數(shù)直方圖（圖1）來分析結果。2組患者中，感染組的全血CD64水平均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表3。

2.3 ROC曲線圖及CRP、SAA和CD64診斷新生兒感染性疾病的敏感性和特異性分析

根據(jù)CRP、SAA及CD64的結果繪制ROC曲線（圖2）。計算CRP、SAA及CD64的ROC曲線下面積分別為0.600、0.567、0.870，最佳截斷值分別為CRP≥8 mg/L、SAA≥6 mg/L、CD64≥2 943個熒光抗體分子/細胞。

表3 感染組和對照組全血CD64水平比較Table 3 Comparison of whole blood CD64 between the infected group and control group

圖2 CRP、SAA及CD64的ROC曲線Figure 2 The ROC curves of CRP，SAA and CD64

CRP診斷新生兒感染性疾病的敏感性和特異性分別為58.23%、68.92%；SAA分別為64.21%、64.65%，而CD64分別為92.31%、90.43%，以CD64的敏感性和特異性最強。

3 討論

新生兒感染性疾病主要包括病毒感染性疾病和細菌感染性疾病，如敗血癥、手足口病等，這類疾病是造成新生兒死亡的主要原因之一。常規(guī)的血液檢查如白細胞計數(shù)等，目前國內(nèi)尚無新生兒的血常規(guī)參考值，各醫(yī)院的檢查方法缺乏標準化，陽性率不高，且標本容易受到污染，指導臨床治療相對滯后，也不能達到早期診斷的目的。因此，尋找高效、可靠、合理且操作方便的早期新生兒疾病感染標記物，具有極其重要的意義。

本研究所探討的3種診斷新生兒感染性疾病的標志物在過去的研究中都有過類似的報道。CRP的合成場所主要是肝臟，正常的新生兒出生早期自身免疫功能較低、免疫反應不成熟，導致其炎癥反應較弱，因而血液中的含量非常低［4］。但是在過去的研究中，Lannergard等［10］發(fā)現(xiàn)，CRP和白細胞等都是非特異性的輔助診斷參考指標，不同個體之間的差異極為顯著，而且經(jīng)常受到感染性疾病以外的影響因素的干擾。因此，運用白細胞和CRP 2個指標作為新生兒感染性疾病的早期診斷均有可能誤判。與李松等人［7］研究結果一致，本研究顯示，CRP對于新生兒感染性疾病的判斷均具有較低的特異性和敏感性，其主要原因可能是因為CRP主要是細菌性炎癥的活動指標，而新生兒感染性疾病的種類繁多，成因復雜，并不僅僅主要是由細菌性炎癥導致，因此，CRP對于新生兒感染性疾病的早期診斷有一定的參考價值，但并不能成為診斷的金標準。

SAA也是一種在急性時由肝臟分泌的反應蛋白，與CRP一樣，在炎癥和組織損傷時，會明顯升高。但SAA是病毒性炎癥的活動指標，CRP在細菌感染性疾病時明顯增高，而SAA在細菌感染性疾病時比CRP升高更早，下降更快，幅度更大，在除細菌以外等其他應急狀態(tài)如病毒感染、呼吸道感染等發(fā)生時明顯增高［10］。有報道指出，檢測SAA/CRP的比值，對SAA與CRP進行聯(lián)合檢測，比單獨檢測SAA或CRP具有更大的應用價值，聯(lián)合檢測CRP和SAA在血液中的含量可極大地提高早期的診斷效率，SAA/CRP的比值與新生兒感染性疾病存在相關性［11］。因此，SAA為臨床診斷的正確性和可靠性又增加了一個新的指標。本研究顯示，在臨床表現(xiàn)為疑似新生兒感染性疾病時，SAA均明顯高于對照組，多種感染性疾病均能出現(xiàn)SAA增高的情況，對于新生兒感染性疾病的早期診斷具有較高的敏感性，但是其特異性不高。與Harr和Ulutas等［12-13］報道一致，SAA在寄生蟲感染與外傷等情況下，也會明顯增加，這種在多種急性時均出現(xiàn)SAA增高的情況，一方面能使得SAA得到更廣泛的應用，另一方面也說明，SAA作為診斷新生兒感染性疾病的標準，特異性并不高。

CD64是一種免疫球蛋白，正常情況下，大部分分布在外周血的巨噬細胞及其他細胞中，中性粒細胞表達較低［15］。有研究報道指出，CD64在非感染性炎癥及病毒感染時均不會表達增加，從而說明CD64在早期診斷新生兒細菌性感染時具有較高的特異性［14-15］。本研究顯示，與對照組的新生兒相比，疑似感染性疾病的新生兒，其CD64的表達水平顯著升高，且不受胎齡影響。CD64的檢測還可以使用免疫熒光染色，通過流式細胞分析儀快速檢測，不僅操作簡單，而且結果重復性好，通常在2 h內(nèi)就可以完成檢測，可為臨床早期快速診斷提供重要的信息。與本研究結果一致，汪盈等［15］也在研究中發(fā)現(xiàn)，CD64對新生兒感染性疾病的診斷具有較好的敏感性和特異性，而且隨著感染程度的不同，CD64的表達水平也有所不同，是早期診斷新生兒敗血癥的靈敏指標。

綜上所述，新生兒感染性疾病中，CRP、SAA、CD64水平的檢測都對早期診斷具有一定的幫助。本研究表明，與CRP和SAA相比，CD64具有更高的敏感性和特異性，是新生兒感染性疾病早期診斷的靈敏指標，但目前臨床上采用2個或2個以上感染標記物的聯(lián)合檢測來診斷新生兒感染性疾病發(fā)生的報道越來越多，對新生兒的早期診斷和治療具有積極作用。