賈琴妹孫樂滿寶華★

普羅威登斯菌屬（Providencia）腸桿菌科細菌，是腸道中正常菌群之一。該菌屬在自然界中分布廣泛，屬于條件致病菌。普羅威登斯菌屬包括產(chǎn)堿普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens，P.alcalifaciens）、斯氏普羅威登斯菌（Providencia stuartii，P.stuartii）、雷氏普羅威登斯菌（Providen-cia rettgeri，P.rettgeri）、魯氏普羅威登斯菌（Providencia rustigianii，P.rustigianii）和亨巴赫普羅威登斯菌（Providencia heimbochae，P.heimbochae）。雷氏普羅威登斯菌極易在食品的加工、運輸、銷售等過程中大量繁殖而導致腸道感染和食物中毒［1］。此外，國內(nèi)外還有該菌引起的旅行者腹瀉、眼部感染、菌血癥、尿路感染等相關報道［2-3］。本文將報道1株來自足部感染的耐碳青霉烯類雷氏普羅威登斯菌及其耐藥機制，從而來加強醫(yī)務人員的認識，意識到合理使用抗菌藥物的重要性。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

患者，男性，60歲，因“右足踇趾紅腫半月，發(fā)黑、流膿、發(fā)熱3 d”入住云南省第三人民醫(yī)院。專科檢查：右足背稍腫脹，色素沉著，踇趾發(fā)黑，惡臭，踇趾根部掌側見鴿子蛋大小軟組織缺損，見踇趾屈肌腱，無明顯滲出，踇趾部分功能存在，感覺消失，余各指感覺稍減退。既往有糖尿病史20余年。入院檢查：血生化示血糖9.8 mol/L；尿常規(guī)示葡萄糖2+，酮體陰性；血常規(guī)示白細胞12.16×109/L、中性粒細胞占72%；予抗炎和降血糖治療。踇趾根部掌側滲出液培養(yǎng)示雷氏普羅威登斯菌，治療5 d后，再次培養(yǎng)，結果無細菌生長。繼續(xù)治療7 d后，所有癥狀好轉，給予出院。

1.2 菌株來源

分離得到的雷氏普羅威登斯菌源于云南省第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科某糖尿病患者右足踇趾根部掌側潰破處。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC25922），購自國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心。

1.3 儀器與試劑

VTEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀及配套鑒定/藥敏卡購自法國生物梅里埃公司生產(chǎn)；CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司產(chǎn)品；旋渦混合器VDRTEX-5購自海門其林貝爾儀器制造有限公司；PCR擴增儀購自美國PE公司；電泳儀購自美國Tanon公司；紫外凝膠成像儀購自上海復日生物技術有限公司。

1.4 菌株的分離培養(yǎng)、鑒定與體外藥物敏感性試驗

無菌采集患者足部感染灶中分泌物樣本，接種于血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和巧克力瓊脂平板等（鄭州安圖生物有限公司生產(chǎn)），置CO2溫箱37℃孵育24 h。隨后挑取純菌落，采用Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定儀及配套鑒定卡/藥物敏感性卡，進行菌種鑒定和體外藥物敏感性試驗，確定其最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。同時采用美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的紙片擴散法（英國Oxoid公司產(chǎn)品）來補充藥物敏感性卡中沒有覆蓋到的抗菌藥物。

1.5 碳青霉烯酶表型的檢測

1.5.1 改良Hodge實驗（modified Hodge test，MHT）方法

將0.5麥氏濁度的大腸埃希菌（ATCC25922）菌懸液進行1∶10稀釋后均勻涂布于水解酪蛋白胨瓊脂平板上，待其干燥后將厄他培南紙片置于平板正中心；使用接種環(huán)挑取菌落從紙片邊緣向平板邊緣垂直劃線，37℃孵育16～18 h觀察結果。如果在被測菌株與大腸埃希菌（ATCC25922）抑菌圈交匯處，大腸埃希菌生長增強，即產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.5.2 乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetra acetic acid，EDTA）協(xié)同實驗

將0.5麥氏濁度的待檢菌懸液涂布于水解酪蛋白胨瓊脂平板上，待其干燥后將亞胺培南（10 μg）紙片置于距離EDTA紙片（4 μg）1 cm平板表面，37℃孵育16～18 h觀察結果。當亞胺培南抑菌圈在靠近EDTA紙片側明顯擴大者為產(chǎn)金屬類碳青霉烯酶。

1.6 碳青霉烯酶耐藥基因檢測

根據(jù)文獻報道合成聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物，引物序列見表1，包括最為常見的KPC酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶（MBLs）IMP、VIM、NDM-1以及苯唑西林酶OXA-48［4-5］。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，陽性PCR產(chǎn)物送上海生工公司測序。

2 結果

2.1 體外藥物敏感性試驗

雷氏普羅威登斯菌對氟喹諾酮類、大部分氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，對阿米卡星敏感，見表2。

表1 編碼碳青霉烯酶耐藥基因引物序列及擴增片段長度Table 1 The drug resistance gene primer sequence and amplification fragment length of carbapenemases

2.2 碳青霉烯酶表型檢測結果

改良Hodge試驗陽性，見圖1。

EDTA協(xié)同試驗陰性，見圖2。

2.3 碳青霉烯酶耐藥基因檢測結果

通過對KPC、IMP、VIM、NDM-1、OXA-48共5種常見碳青霉烯酶基因的擴增，blaKPC為陽性，其余均為陰性，見圖3。測序結果顯示檢出的KPC與KPC-2有99%同源（GenBank登錄號：FJ628167）。

3 討論

表2 雷氏普羅威登斯菌藥物敏感性結果Table 2 The results of the drug sensitivity of Providencia rettgeri

由于抗菌藥物不合理不規(guī)范的廣泛應用，再加隨后的“王牌”抗菌藥物——碳青霉烯類藥物備受臨床青睞，用量增多，導致多重耐藥及泛耐藥細菌日趨嚴重，其中耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）是重要組成成員之一，給人類健康帶來嚴重的威脅。CRE主要的耐藥機制是產(chǎn)碳青霉烯酶，目前國外最流行的主要有KPC、IMP、VIM、NDM酶［6-7］，而國內(nèi)主要流行的為KPC和IMP酶［8］，新德里金屬 β 內(nèi)酰胺酶-1（NDM-1）也有散在報道［9］。KPC型酶是一種幾乎能水解所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的A類水解酶。2001年首次由Yigit等［10］在美國北卡羅納州從肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)KPC-1型，2003年KPC-2型在馬里蘭從肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)。2004年我國首次在浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院從肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了KPC酶［11］。目前為止，GenBank已記錄的KPC型酶有14亞種，全球范圍內(nèi)報道的KPC型酶多以KPC-2型和KPC-3型為主，國內(nèi)以KPC-2型為主，且產(chǎn)KPC型酶的細菌以肺炎克雷菌為主。本報道中檢測到的碳青霉烯酶就是國內(nèi)主要流行的KPC-2型，未檢測到IMP、VIM、NDM-1、OXA-48型等，且產(chǎn)酶菌株是從糖尿病足患者踇趾根部掌側滲出液中分離培養(yǎng)出來的雷氏普羅威登斯菌，此菌屬腸桿菌科細菌。從本文藥物敏感性實驗結果可知這株雷氏普羅威登斯菌已是泛耐菌，其耐藥機制除了產(chǎn)KPC-2型酶外，可能還存在其他的耐藥機制，如：膜孔蛋白缺失、高水平產(chǎn)生頭孢菌素酶（AmpC）或突變聯(lián)合ESBLs、外排泵的過度表達等［12］，其中產(chǎn)生碳青霉烯酶KPC-2可能是這株菌最主要的耐藥機制。同時，從本報道可知產(chǎn)碳青霉烯酶的細菌不僅僅局限于肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和鮑曼不動桿菌復合菌等分離培養(yǎng)較常見的細菌，而是細菌種類在向多樣化方向發(fā)展，且存在著向不常見細菌種類蔓延趨勢，這不單說明是產(chǎn)酶菌株種類在逐年涌現(xiàn)，更體現(xiàn)了碳青霉烯酶耐藥基因可能在細菌之間存在水平傳播或全球范圍的擴散，所以醫(yī)務人員應加強警惕，防止局部流行或爆發(fā)感染。

圖1 改良Hodge實驗檢測碳青霉烯酶Figure 1 The modified Hodge test of detection carbapenemases

圖2 EDTA協(xié)同實驗檢測碳青霉烯酶Figure 2 EDTA collaborative test of detection carbapenemases

圖3 PCR擴增雷氏普羅威登斯菌碳青霉烯酶耐藥基因Figure 3 PCR amplification resistance gene of carbapenemases of Providencia rettgeri

雷氏普羅威登斯菌主要分離自人的尿液、血液或痰液，很少分離自分泌物樣本。本報道中雷氏普羅威登斯菌不僅感染部位及來源特殊，而且產(chǎn)碳青霉烯酶，在國內(nèi)相關文獻報道中也是較少見，但也偶有報道［13］產(chǎn)NDM-1及ESBLs的雷氏普羅威登斯菌，如：2011年我國廣東省某三甲醫(yī)院從患者肝膿腫引流液中分離出一株產(chǎn)碳青霉烯類酶NDM-1型的雷氏普羅威登斯菌［14］，除此之外至今未見其它相關的報道。國外已有多篇文獻［15-17］報道雷氏普羅威登斯菌屬可產(chǎn)生IMP-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶以及各種β-內(nèi)酰胺酶，如CTX-M-15、VEB-1a和PER-1型ESBLs和ArmA型16SrRNA甲基化酶等［18］。這說明國內(nèi)國外對這種不常見菌株都面臨著耐藥性升高的難題，具體原因還需結合當?shù)厍闆r分析，找到有效的解決方法與措施，控制其繼續(xù)傳播。

近幾年，國內(nèi)外相關普羅威登斯菌屬的報道在不斷增多，其耐藥問題應引起足夠的重視，盡量做到防止或減少多重耐藥菌株（主要是產(chǎn)碳青霉烯酶菌株）的出現(xiàn)，原因是產(chǎn)碳青霉烯酶細菌感染常伴隨高致殘率或高死亡率等嚴重后果，且編碼碳青霉烯酶的基因大部分位于可移動基因元件（質(zhì)?；蜣D座子）上，可以在不同的種屬之間經(jīng)接合、轉導，轉染、插入等進行傳播［19-21］，而且可通過醫(yī)療器械及醫(yī)務工作者等多種途徑在患者間傳播和交叉感染，具有局部暴發(fā)流行的潛在危害。因此，快速、準確地檢測產(chǎn)酶菌株，對于患者的治療、防止耐藥基因的播散具有重要意義，與此同時，醫(yī)護人員應提高意識，加強全院耐藥監(jiān)測、嚴格執(zhí)行手衛(wèi)生和消毒隔離等措施。本報道也再次敲響警鐘：規(guī)范合理使用抗菌藥物。目前，市場上的抗菌藥物已經(jīng)趕不上細菌的變異速度，新的藥物還在研發(fā)中，所以全球都面臨著受威脅的困難處境?？傊?，為了全人類的健康，我們呼吁嚴格使用抗菌藥物，加快新藥問世的步伐。