譚烈明 鄧藝燕

手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）是兒童常見的傳染性疾病，該病于5歲以下兒童多發(fā)，以手、足、口多發(fā)皰疹為主要特征，病情發(fā)展快，可導(dǎo)致個(gè)別重癥患兒死亡［1］。目前已有20多種腸道病毒可引發(fā)手足口病，最為常見的是腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒A16型（coxsackievirus A16，CA16）引起［2-4］，并且在全球多次大規(guī)模爆發(fā)流行。近年來，HFMD的病原除主要型別外，由其他型別所引起的HFMD，也逐漸被認(rèn)識。為了解玉林市HFMD的主要病原譜構(gòu)成，現(xiàn)對玉林市紅十字會(huì)醫(yī)院2014年1月至2017年12月共32 077例HFMD臨床送檢標(biāo)本的病原學(xué)檢測結(jié)果進(jìn)行分析，為手足口病防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

采集2014年1月-2017年12月臨床診斷為HFMD患者的肛拭子標(biāo)本共32 077例，其中男性19 505例，女性12 572例，年齡10天至73歲，平均年齡（2.1±0.02）歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

由護(hù)士或醫(yī)生采集標(biāo)本，采集前由專業(yè)人員對采集規(guī)范進(jìn)行培訓(xùn)。肛拭子：可用棉簽由肛門插入直腸內(nèi)采取，使拭子變成濕潤并染有一些糞便顏色。將棉簽放入內(nèi)裝有2 mL生理鹽水的采樣管中并保存于2～8℃冰箱。

1.2.2 病毒RNA提取

使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提取試劑盒（離心柱提法）提取RNA，充分混勻標(biāo)本后，取100 μL加入50 μL的蛋白酶K和200 μL的裂解工作液，72℃10 min，加入250 μL乙醇，混勻后，全部移入離心柱中，離心，純化，洗脫，提取好的RNA可以直接用于檢測，也可存于-20℃，24 h內(nèi)完成檢測。

1.2.3 熒光定量PCR核酸檢測

使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供的熒光定量PCR試劑盒（PCR-熒光探針法），反應(yīng)體系：RT-PCR反應(yīng)液15 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL、Taq酶3 μL；上述PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的陰性質(zhì)控品、待測樣品混濁液、陽性質(zhì)控品各5 μL，3 000 r/min離心30s，放入PCR擴(kuò)增儀。在瑞士羅氏cobas480實(shí)時(shí)熒光PCR儀器上進(jìn)行RNA檢測，具體反應(yīng)條件參照試劑盒說明書。

1.2.4 結(jié)果判斷

陰性質(zhì)控品：無典型S型擴(kuò)增曲線或無Ct值；陽性質(zhì)控品：呈典型S型擴(kuò)增曲線且Ct值≤30；如果檢測結(jié)果無典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值＞34.9，則判斷標(biāo)本為陰性；如果檢測結(jié)果呈典型S型擴(kuò)增曲線且Ct值≤34.9，則判斷標(biāo)本為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，采用χ2檢驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原譜構(gòu)成

共檢測32 077份標(biāo)本，其中腸道病毒陽性率為80.1%（25 870/32 077），其中EV71型陽性檢出率為12.4%（3 203/25 870），CA16型陽性檢出率為5.4%（1 402/25 870），非EV71/CA16型陽性檢出率為82.2%（21 265/25 870）。4年間，非EV71/CA16型的陽性與EV71型和CA16型的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2 851.99，P=0.000，P＜0.01），見表1。

表1 2014 -2017年玉林市各年手足口病核酸檢測結(jié)果Table 1 Results of nucleic acid detection of hand，foot and mouth disease in Yulin City，2014-2017

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果

陽性檢測結(jié)果的擴(kuò)增曲線呈典型S型擴(kuò)增曲線且Ct值≤34.9。陰性檢測的結(jié)果無典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值＞34.9（圖1，圖2）。

圖1 熒光定量PCR檢測曲線Figure 1 The curve of RT-PCR

2.3 年齡分布特征

從年齡分布來看，玉林市2014至2017年發(fā)病年齡最小為10 d，最大為73歲，發(fā)病的人群以5歲以下兒童為主，占97.97%（25 345/25 870）。其中0～3歲兒童發(fā)病最多，占總病例數(shù)的89.98%（23 278/25 870）。CA16型和EV71型的陽性率在所有年齡組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.48，P=0.48，P＞0.05）。非EV71/CA16組與CA16組、EV71組在各年齡組中分別比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=424.35，P=0.000，P＜0.01），見表2。

圖2 熒光定量PCR檢測曲線圖Figure 2 The curve of RT-PCR

2.4 性別分布

手足口病病毒在男性與女性之間的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.093，P=0.955，P＞0.05），說明病毒感染在不同性別患者中的感染情況無差異，見表3。

表2 2014 -2017年玉林市手足口病各年齡段分布情況Table 2 Distribution of hand，foot and mouth Disease by age in Yulin City，2014-2017

2.5 月份分布特征

2014-2017年各月均有發(fā)病，發(fā)病具有明顯的季節(jié)性，呈雙峰型分布。4月開始上升，隨后的5～7月持續(xù)處于高發(fā)水平，此為春夏高峰，是發(fā)病的最高峰。自7月開始病例數(shù)逐漸遞減，進(jìn)入9月后病例數(shù)開始反彈上升，為發(fā)病的次高峰。春夏高峰的流行周期長于秋冬高峰（圖3）。

表3 2014 -2017年玉林市手足口病患者性別的分布情況Table 3 Gender Distribution of hand，foot and mouth disease in Yulin City，2014-2017

圖3 2014 -2017年不同月份手足口病發(fā)病人數(shù)分布Figure 3 The incidence of HFMD in different months from 2014 to 2017

3 討論

手足口病在我國流行強(qiáng)度較大，自2008年以來全國很多地方爆發(fā)過較大規(guī)模，已成為危害我國兒童健康的重要公共衛(wèi)生問題［5］。因此對于流行季節(jié)的實(shí)驗(yàn)室診斷，采用簡便、快捷、準(zhǔn)確的技術(shù)則是實(shí)驗(yàn)室診斷的關(guān)鍵。qPCR是將PCR技術(shù)和熒光檢測技術(shù)結(jié)合起來實(shí)現(xiàn)了對核酸的自動(dòng)化檢測的技術(shù)，其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用PCR對DNA的高效擴(kuò)增，運(yùn)用高特異性的探針和高敏感性的光譜技術(shù)檢測目的片段及定量。因此熒光定量基因檢測方法可準(zhǔn)確、靈敏地反映感染數(shù)量和治療恢復(fù)情況，對手足口病早期診斷和療效的觀察具有重要的指導(dǎo)作用。

本文通過對玉林市2014-2017年手足口病病原體流行特征監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，玉林市手足口病全年均可發(fā)病，且發(fā)病存在季節(jié)性變化，病例主要集中在4～9月，這與胡躍華、孫軍玲等［6-7］報(bào)道的手足口病在夏、秋季均有明顯流行高峰一致。玉林市2014-2017年手足口病的發(fā)病人群為主要是5歲以下兒童，其中0～3歲兒童發(fā)病數(shù)最多，此結(jié)果與劉瑩瑩、杭惠等［8-10］報(bào)道的結(jié)果相符，該現(xiàn)象可能與人群免疫水平及個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣有關(guān)，5歲以下兒童免疫水平較低，衛(wèi)生意識淡薄，容易受到各種細(xì)菌病毒入侵，疾病感染的風(fēng)險(xiǎn)增大。故兒童在0～3歲時(shí)發(fā)病最多，5歲后較少。從性別來看，男童發(fā)病例數(shù)高于女童，可能與男童好動(dòng)，活動(dòng)范圍較女童廣，個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣不如女童有關(guān)。因此，在每年夏、秋季加強(qiáng)對5歲以下兒童，尤其是0～3歲男童的手足口病防控，可有效控制手足口病的蔓延。

葉瑞國等［11］報(bào)道2012年玉林市手足口病主要以EV71型和CA16型為優(yōu)勢流行毒株。本研究發(fā)現(xiàn)2014年EV71型陽性率為29%，CA16型為7.5%，非EV71/CA16型陽性率為63.5%。并且2015-2017年非EV71/CA16型腸道病毒所占的比例逐漸增加，比率從63.5%升至90.7%。說明從2014年起玉林市流行季HFMD的腸道病毒感染已從EV71型和CA16型占主要，改變到非EV71/CA16型成為主要流行株，與朱俊萍、關(guān)恒云等［12-13］報(bào)道的手足口病病原研究結(jié)果基本一致，和國內(nèi)外有關(guān)報(bào)道相似［14-15］。目前，國內(nèi)有關(guān)HFMD致病機(jī)制和預(yù)防治療關(guān)注的焦點(diǎn)主要集中于EV71型和CA16型2種病原，但是近年來國內(nèi)很多地方報(bào)道EV71和CA16型感染比率已經(jīng)減少，其它型別腸道病毒在HFMD流行中所占比例明顯增加。從2010年起，陳前進(jìn)、趙虹等［16-18］陸續(xù)報(bào)非EV71/CA16型病毒株逐漸在國內(nèi)HFMD中逐漸成為優(yōu)勢流行病毒株。廖琳虹、邱惠芳等［19-23］也發(fā)現(xiàn)其他腸道病毒感染成為HFMD的重要組成部分。目前，玉林市手足口病常規(guī)的病原學(xué)檢測僅針對腸道病毒通用、EV71型和CA16型，而非EV71/CA16型病毒株逐漸成為引發(fā)手足口病暴發(fā)流行的優(yōu)勢菌株，為了預(yù)防和控制手足口病的暴發(fā)流行，下一步要對非EV71/CA16型病毒株進(jìn)行基因分型，期待更多腸道病毒分型產(chǎn)品應(yīng)用于臨床。

因此，加強(qiáng)對玉林市手足口病其他型別病原體的監(jiān)測，確立更為精確、全面的腸道病毒分型，建立并完善玉林市手足口病詳細(xì)病原譜，把握手足口病病原體流行趨勢，可為今后手足口病的診治、日常監(jiān)測和防控工作提供科學(xué)依據(jù)。