張亞洲 ，王 濤 ，朱晶晶 ，2，劉 學(xué) ，2，周福才 ，王 強(qiáng)

（1.貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550003； 2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001； 3.廣西苷亮健生物技術(shù)有限公司，廣西 南寧 530001）

木姜葉柯為殼斗科柯屬植物 Lithocarpuslitseifolius（Hance）Chun.，屬常綠喬木，別名甜茶（通稱）、甜葉子樹(shù)（云南）、胖稠（廣東）、甜味菜、大葉稠子、甘茶（貴州）、多穗石柯等，以野生狀態(tài)分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南各省區(qū)海拔500～2 500 m的低山密林中，印度、泰國(guó)也有分布[1]。現(xiàn)代研究表明，木姜葉柯中的黃酮類成分是其主要化學(xué)成分，主要有根皮苷與三葉苷，屬二氫查爾酮類成分[2－4]。木姜葉柯（甜茶）使用廣泛，于2017年6月通過(guò)了國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委的新資源食品評(píng)審，其具有降血糖、降血壓、調(diào)血脂及抗過(guò)敏、抗炎等作用，尤其所含根皮苷防治糖尿病及其并發(fā)癥有獨(dú)特效果[5－8]。本研究中對(duì)收集的主要產(chǎn)區(qū)的木姜葉柯各種市售甜茶成品及原植物中根皮苷與三葉苷含量進(jìn)行測(cè)定，以了解市場(chǎng)上產(chǎn)品及原植物中根皮苷及三葉苷的含量，為木姜葉柯產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供借鑒?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Series型高效液相色譜儀（包括1260 DAD型檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；BSA124S型分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司）；KQ－300DB型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

乙腈，甲醇（均為HPLC級(jí)，成都科龍?jiān)噭┯邢薰荆?；磷酸（分析純，北京化工廠）；水為娃哈哈純凈水；根皮苷對(duì)照品（含量＞99%，批號(hào)為20161012），三葉苷對(duì)照品（含量 ＞98%，批號(hào)為20160825），均購(gòu)于成都德思特生物技術(shù)公司。木姜葉柯樣品為廣西

表1 收集的木姜葉柯原植物部位及茶的樣品信息

2 方法與結(jié)果[9－15]

2.1 藥材水分測(cè)定

參照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》附錄0832（干燥失重測(cè)定法第二法）測(cè)定藥材水分。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 木姜葉柯藥材水分測(cè)定結(jié)果（n＝3）

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

紫外－可見(jiàn)吸收光譜（UV）圖顯示根皮苷在285 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，而三葉苷在275 nm波長(zhǎng)處有最大吸收（見(jiàn)圖1），綜合考慮，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

圖1 紫外光譜圖

2.3 樣品溶液制備與超聲時(shí)間選擇

稱取以上木姜葉柯樣品0.2 g，精密稱定并平行稱取3份，分別置100 mL容量瓶中，用甲醇超聲10，20，30 min使溶解，放冷后用甲醇稀釋至刻度，搖勻。用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取濾液20μL進(jìn)樣。結(jié)果樣品超聲20 min內(nèi)測(cè)定效果良好。

2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Phenomenex Gemini C18柱（250mm×4.6mm，5μm，美國(guó)菲羅門公司）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液（A）－乙腈（B），梯度洗脫（見(jiàn)表 3）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量20μL。在此條件下，根皮苷、三葉苷理論板數(shù)均大于4 000，分離度均大于1.5，色譜條件符合相關(guān)要求（見(jiàn)圖2）。苷亮健生物技術(shù)公司供應(yīng)或通過(guò)購(gòu)買獲得，樣品均經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院董立莎教授鑒定為木姜葉柯，詳見(jiàn)表1。

表3 流動(dòng)相梯度洗脫表（%）

圖2 高效液相色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：稱取根皮苷對(duì)照品25.0 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得A溶液；精密稱取三葉苷對(duì)照品23.0 mg置20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得B 溶液。分別精密吸取 A 溶液 4.00，3.00，2.00，1.00，0.50，0.20，0.10 mL，B 溶液 5.00，4.00，3.00，2.00，1.00，0.50，0.25 mL；置 10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列質(zhì)量濃度溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)：取2.5項(xiàng)下對(duì)照品溶液，搖勻，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20μL，計(jì)算峰面積。結(jié)果根皮苷、三葉苷峰面積平均值分別為2 968.5和10 383.9，RSD分別為0.47%和0.37%（n＝6），表明儀器精密度較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.3項(xiàng)下方法制備的同一樣品溶液，搖勻后，用微孔濾膜濾過(guò)，分別于 0，2，4，6 h 時(shí)進(jìn)樣20μL。平行操作2次，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果根皮苷的相對(duì)百分含量分別為100.00%，100.18%，99.96%，100.24%，三葉苷的相對(duì)百分含量分別為100.00%，99.84%，99.93%，100.10%，表明樣品溶液在6 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取同一份樣品（編號(hào)12）0.2 g（稱樣量分別為 0.200 3，0.201 2，0.200 2 g），精密稱定并平行稱取3份，分別用2.3項(xiàng)下樣品溶液制備方法配制，進(jìn)樣20μL。結(jié)果根皮苷和三葉苷的平均峰面積分別為 14 856.4和51 200.5，RSD分別為0.68%和0.18%（n＝6），表明方法的重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量樣品（編號(hào)12）0.1 g，精密稱定并平行稱取9份，分別平行加入已知含有根皮苷（1.996 g／L）、三葉苷（6.034 g／L）的高、中、低濃度（125%，100%，75%）對(duì)照品溶液各3份，按樣品含量測(cè)定方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.6 樣品含量測(cè)定

按2.3項(xiàng)下樣品處理方法處理樣品，依法測(cè)定含量。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 藥材樣品中根皮苷、三葉苷含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）

3 討論

木姜葉柯在民間當(dāng)茶葉使用，其成分至今較為明確的有根皮素、根皮苷和三葉苷等，有降血糖、降血壓、調(diào)血脂及抗過(guò)敏、抗炎等作用。

曾探索在同一色譜條件下同時(shí)對(duì)根皮素、根皮苷和三葉苷進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分樣品中根皮素含量太低，導(dǎo)致無(wú)法同時(shí)與根皮苷和三葉苷進(jìn)行測(cè)定。對(duì)部分市場(chǎng)上及自采的木姜葉柯樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)收集到的不同產(chǎn)地的15批樣品根皮苷與三葉苷的含量存在一定差異。老葉與枝條中成分以根皮苷為主，最高含量達(dá)9.04%，茶葉制品與鮮葉中成分以三葉苷為主，最高含量達(dá)24.35%。另就根皮苷與三葉苷總量而言，茶葉制品與鮮葉遠(yuǎn)大于老葉和枝條，其中以標(biāo)示產(chǎn)地為廣西南寧南陽(yáng)鄉(xiāng)木姜葉柯種植地區(qū)的質(zhì)量較優(yōu)，根皮苷與三葉苷總的含量相對(duì)較高，達(dá)31.62%，分析原因在于為鮮葉加工而成，成分含量較高，且均以三葉苷為主。

因加工方法的不同，木姜葉柯有綠茶及紅茶2個(gè)品系，但從成分上來(lái)講，制茶加工過(guò)程并未改變鮮葉中三葉苷含量多數(shù)大于根皮苷的情況，故建議木姜葉柯茶制品應(yīng)在4月至9月用其鮮葉加工，所得品次較高。