喻 吉 ，林 彩 ，孫紅武 ，2△，楊欽君

（1.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400038； 2.國家免疫制品工程技術(shù)研究中心·中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系微生物與生化藥學(xué)教研室，重慶 400038）

氯霉素對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌等有效，尤其對引起痤瘡的痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌等具有顯著抗菌作用[1]。甲硝唑?qū)?dǎo)致痤瘡的厭氧菌及增生性的毛囊蟲有明顯殺滅作用[2]。本研究中以甲硝唑與氯霉素為主藥，配以不同的乳膏基質(zhì)，共獲得7個處方，按乳膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[3－4]考察乳膏質(zhì)量，獲得最優(yōu)處方，制備出復(fù)方氯霉素乳膏。由于復(fù)方氯霉素乳膏中，甲硝唑與氯霉素對臨床療效具有至關(guān)重要的作用，因此對其兩種主藥的含量測定對于其質(zhì)量控制具有重要意義。目前，甲硝唑與氯霉素的含量測定方法有高效液相色譜（HPLC）法、雙波長分光光度法、多波長系數(shù)法、比色法等，HPLC法具有重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點[5－8]。本研究中擬建立同時測定復(fù)方氯霉素乳膏中甲硝唑與氯霉素含量的HPLC法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BME－1002型高剪切乳化機（上海威宇機電有限公司）；KQ－600V型離心機（上海威爾機電制造有限公司）；TE4101－L型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；KQ－400KDE型高功率數(shù)控超聲清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）；DU650型紫外分光光度計（Beckman Coulter公司）；Waters2487型高效液相色譜儀紫外檢測器、Waters 510 Pump型高效液相色譜儀二元泵（美國Waters公司）；Diamondsil C18色譜柱（150 mm ×4.6 mm，5μm，迪馬科技有限公司）；Mini－Q Plus 1.5 L／min型純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

甲硝唑（武漢武藥制藥有限公司，批號為150380）；氯霉素（南京白敬宇制藥有限公司，批號為CH150404）；螺內(nèi)酯（浙江郎華制藥有限公司，批號為1501004）；甘油（批號為 20150314），吐溫 － 80（批號為 20140501），均由湖南爾康制藥股份有限公司生產(chǎn)；HR－S乳化劑（丹東安康精細(xì)化工有限公司，批號為20150407213）；白凡士林（南昌白云藥業(yè)有限公司，批號為20150603）；丙二醇（南京威爾化工有限公司，批號為20150503）；單硬脂酸甘油酯（沈陽科瑞化工有限公司，批號為20140925）；硬脂酸（湖州展望藥業(yè)股份有限公司，批號為20141205）；16－18醇（江蘇東泰精細(xì)化工有限公司，批號為2014121204）；Span－60（河南正通化工有限公司，批號為20150210）；十二烷基硫酸鈉（成都華邑藥用輔料制造有限責(zé)任公司，批號為20140501）；液體石蠟（吉林市吉化江城油脂化工有限責(zé)任公司，批號為150202）；甲硝唑?qū)φ掌罚ㄅ枮?00191－201507），氯霉素對照品（批號為130555－201203），均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇（色譜純，美國Burdick＆Jackson公司）；復(fù)方氯霉素乳膏（自制，批號分別為 160105－1，160105－2，160126 －1，160126 －2，160126 －3）。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方設(shè)計與篩選

2.1.1 處方設(shè)計

按復(fù)方氯霉素乳膏基質(zhì)成分配制比例及配制溫度，篩選處方，設(shè)計出7個處方。詳見表1。其中配置溫度除處方3為60℃外，其余處方均為80℃。

表1 復(fù)方氯霉素乳膏處方（g）

2.1.2 乳膏制備

處方1，2，6：油相，按處方量稱取單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、Span－60，混合加熱，熔化，加入螺內(nèi)酯使其溶解，溶液保持80℃。水相，按處方量稱取水，加熱至80℃后，加入甲硝唑與氯霉素，攪拌，使其完全溶解，然后加入甘油或丙二醇、吐溫－80混勻。將80℃油相加至80℃的水相。

處方3：油相，按處方量稱取單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、Span－60，混合加熱，熔化，加入螺內(nèi)酯使其溶解，溶液保持60℃。水相，按處方量稱取水，加熱至60℃后，加入甲硝唑與氯霉素，攪拌，使其完全溶解，然后加入甘油或丙二醇、吐溫－80混勻。將60℃油相加至60℃的水相。

處方4，7：油相，按處方量稱取16－18醇、單硬脂酸甘油酯、輕質(zhì)液狀石蠟，混合加熱，熔化，然后加入螺內(nèi)酯使其溶解，溶液保持80℃。水相，按處方量稱取水，加熱至80℃后，加入甲硝唑與氯霉素，攪拌使其完全溶解，然后加入十二烷基硫酸鈉、甘油后混勻。將80℃水相加至80℃的油相。

處方5：油相，按處方量稱取單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、16－18醇、輕質(zhì)液狀石蠟，混合加熱，熔化，然后加入螺內(nèi)酯使其溶解，溶液保持80℃。水相，按處方量稱取水加熱至80℃后，加入甲硝唑與氯霉素，攪拌，使其完全溶解，然后加入甘油、HR－S乳化劑后混勻。將80℃油相加至80℃的水相。

各處方油相水相相加時均隨加隨攪拌，攪勻后上機乳化25 min，冷卻，分裝。

2.1.3 質(zhì)量評價與處方篩選結(jié)果

對復(fù)方氯霉素乳膏外觀、黏稠度、粒度、4 000 r／min離心10 min后的穩(wěn)定性、晶體析出時間進(jìn)行考察，判定制備的復(fù)方氯霉素乳膏的質(zhì)量。對制備的7個復(fù)方氯霉素乳膏處方的試驗結(jié)果表明，處方5制備的乳膏最美觀，手感最細(xì)膩，粒度最小，黏稠度適中，且最穩(wěn)定。故處方5為最佳處方。

2.2 含量測定

2.2.1 檢測波長確定

稱取甲硝唑?qū)φ掌放c氯霉素對照品10 mg，精密稱定，分別用甲醇溶解稀釋，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果甲硝唑、氯霉素最大吸收波長分別為273 mm和295 nm，綜合考慮，選擇280 nm為檢測波長。

2.2.2 色譜條件

色譜柱：Diamondsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇 －水（35 ∶65）；檢測波長：280 nm；靈敏度：0.1AUFS；進(jìn)樣量：10μL；流速：1.0mL ／min；柱溫：30℃。

2.2.3 溶液制備

分別稱取甲硝唑與氯霉素對照品各10.1 mg，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度均為0.404 g／L的混合貯備液，配制成對照品溶液。稱取含或不含甲硝唑與氯霉素的復(fù)方乳膏0.13 g，精密稱定，加入甲醇溶解至25 mL容量瓶中，定容并混勻，超聲處理10 min，4 000 r／min離心5 min，取上清液，配制供試品溶液、空白基質(zhì)溶液。

2.2.4 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗與專屬性試驗：取甲硝唑與氯霉素對照品溶液、供試品溶液、空白基質(zhì)溶液，依法進(jìn)樣，色譜圖見圖1?？梢?，對照品溶液中甲硝唑的保留時間為2.244 min，氯霉素為9.510 min；供試品溶液的兩主峰和甲硝唑、氯霉素對照品的色譜峰保留時間基本一致，且兩主藥的分離度好；同時空白基質(zhì)溶液在上述保留時間處無明顯色譜峰，表明其對檢測無明顯干擾。

圖1 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別吸取甲硝唑與氯霉素質(zhì)量濃度均為0.404 g／L的混合貯備液，加甲醇制得兩藥質(zhì)量濃度 均 為 40.40，44.44，48.48，52.52，56.56，60.60，64.64μg／mL的溶液。吸取上述溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，每份溶液測定3次，計算峰面積，以質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，甲硝唑為 Y＝224.49 X－219.4，r＝0.999 9（n＝7）；氯 霉 素 為 Y＝375.5 X－853.11，r＝0.999 8（n＝7）。結(jié)果表明，兩藥質(zhì)量濃度在 40.40～64.64μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系均良好。

精密度試驗：分別量取質(zhì)量濃度為40.40，52.52，64.64μg／mL的甲硝唑與氯霉素溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣3次，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算日內(nèi)精密度。取等量相同溶液，分別于0，24，48 h時注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算日間精密度。結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果（n＝3）

檢測限與定量限確定：將已知質(zhì)量濃度樣品測出的信號與空白樣品測出的信號進(jìn)行比較，計算能被檢測出的最低質(zhì)量濃度與能被定量的質(zhì)量濃度。以信噪比為3∶1時相應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測限，以信噪比為10∶1時相應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限，結(jié)果甲硝唑的檢測限與定量限分別為 1.31μg／mL 和 3.79μg／mL，氯霉素的檢測限與定量限分別為2.28μg／mL和7.33μg／mL。

穩(wěn)定性試驗：精密量取甲硝唑與氯霉素質(zhì)量濃度均為0.404 g／L的混合貯備液，加甲醇制成兩藥質(zhì)量濃度均分別為 40.40，52.52，64.64μg／mL的混合溶液各2份，1 份常溫放置，1 份冰箱（4 ℃）放置，分別于 0，24，48 h時各取10μL注入高效液相色譜儀，記錄甲硝唑與氯霉素的峰面積，并計算 RSD。結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n＝3）

加樣回收試驗：分別配制甲硝唑和氯霉素高、中、低質(zhì)量濃度（67.80μg／mL 和 65.92μg／mL，55.12μg／mL和 53.56μg／mL，42.40μg／mL和 41.20μg／mL）對照品溶液。稱取復(fù)方氯霉素乳膏樣品132.5 mg，精密稱定，依法制備供試品溶液，取0.5 mL，加至3種質(zhì)量濃度的甲硝唑及氯霉素混合對照品液0.5 mL中，混勻，4 000 r／min離心10 min，取10μL注入高效液相色譜儀，計算回收率。結(jié)果見表4和表5。

2.2.5 樣品含量測定

用甲醇分別配制甲硝唑和氯霉素質(zhì)量濃度均為52.00μg／mL的對照品溶液；取5批次的乳膏樣品0.1 g，用甲醇溶解并定容至25 mL，超聲10 min，4 000 r／min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。取甲硝唑與氯霉素對照品混合液、供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄甲硝唑與氯霉素相應(yīng)的峰面積。計算供試品溶液中甲硝唑與氯霉素的質(zhì)量濃度，進(jìn)而計算復(fù)方氯霉素乳膏中甲硝唑與氯霉素的含量。結(jié)果見表6。

表4 甲硝唑加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）

表5 氯霉素加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）

表6 樣品含量測定結(jié)果（n＝5）

3 討論

本研究中以對痤瘡致病菌有效的氯霉素和甲硝唑為主藥[9－11]，設(shè)計出7種不同乳膏的處方，根據(jù)質(zhì)量評價體系，對制劑外觀、粒度、4 000 r／min離心 10 min后的穩(wěn)定性、晶體析出時間等重要質(zhì)量控制指標(biāo)進(jìn)行考察[12]，以獲得最佳處方。

本研究中曾選擇甲醇－水（50∶50）為流動相，結(jié)果甲硝唑與氯霉素峰的保留時間分別為1.85min和3.60min，兩者無法完全分離；流動相為甲醇－水（45∶55）和（40 ∶60）[13－14]時，甲硝唑與氯霉素峰分離效果較好，但甲醇保留時間為1.40 min，與甲硝唑峰分離度不好；當(dāng)流動相為甲醇 －水（35 ∶65）[15]時，甲醇、甲硝唑、氯霉素的分離效果均較好。

在處理復(fù)方氯霉素乳膏樣品時，可對其進(jìn)行超聲處理[15]，增加溶解；樣品進(jìn)樣前，溶液需離心，取上清液，消除基質(zhì)的干擾；由精密度及穩(wěn)定性試驗結(jié)果可見，甲硝唑與氯霉素相應(yīng)項目下的 RSD值均小于2%，表明甲硝唑與氯霉素溶液較穩(wěn)定；測定樣品時，因流動相中甲醇易揮發(fā)，流動相必須使用當(dāng)天配制。